加速腺相關病毒 (AAV) 生產的規模放大是非?？扇〉模詽M足對基因療法日益增長的需求。然而，用于 AAV 基因療法的生物工藝的開發仍然耗時且具有挑戰性。質量源于設計 (QbD) 方法可確保生物工藝設計滿足所需的產品質量和安全性?？焖賶毫y試、可開發性篩選和規?？s小技術有可能在 QbD 框架內簡化 AAV 產品和生物工藝的開發。在這里，我們將回顧它們在抗體生產開發中的成功應用如何轉化至 AAV，以及這將如何在很大程度上取決于改進的分析方法和工具的適應性，因為人們對成功的療法開發所需的 AAV 關鍵屬性有了更多的了解。
基于 AAV 的基因療法的迅速崛起
先進療法的快速開發為腫瘤和罕見病的治療提供了新的可能性。其中，基因療法最近在臨床上取得了成功，顯示出了特別的前景。基因療法的治療效果是通過操縱基因序列或遞送遺傳物質來實現的，迄今為止，已針對多種疾病進行了開發，包括自身免疫性疾病、神經系統疾病、視網膜疾病和各種類型的腫瘤。一些現已獲得監管機構的批準，代表了基因治療發展的重要新里程碑。圖 1 所示的時間表總結了部分已批準療法的發展。
圖 1. 截至2019年細胞和基因治療批準的時間表及其目標適應癥（基因治療，黑色；基于細胞的基因治療產品，藍色）。
遺傳物質的遞送通常需要將它們摻入病毒或非病毒基因遞送載體中，例如脂質納米顆粒、腺病毒或 AAV。本文重點關注 AAV（圖 2A），它是細小病毒家族的一員，也是一種廣泛用于基因治療和疫苗的病毒載體，因為它具有廣泛的細胞嗜性和低免疫原性。野生型 AAV 的基因組包含三個基因，rep、cap 和 aap（圖 2B），分別編碼關鍵病毒復制蛋白、衣殼蛋白（VP1、VP2 和 VP3）和組裝激活蛋白。
圖 2. 腺相關病毒 (AAV) 血清型 2 的結構和基因組。
迄今為止，已在人類（AAV1、AAV2、AAV3、AAV5、AAV6 和 AAV9）和非人靈長類動物中發現了 150 多種 AAV 基因型和 13 種血清型，而在其它物種中發現了更多。它們在細胞嗜性和轉導效率方面有所不同，從而導致不同的功能。
必須修改 AAV 基因組、以使其適合臨床應用。野生型 AAV 可以整合到宿主基因組中，產生永久性和潛在可遺傳的基因修飾，這會給患者帶來重大風險。這些風險已在臨床使用的重組 AAV (rAAV) 中消除，方法是用目的治療基因替換 rep 和 cap 基因中的一個或兩個，并將移除的基因置于僅在 AAV 生產期間使用的單獨質粒上。因此，新的 AAV 顆粒仍然具有感染性，但無法將完整的 AAV 基因組插入人類宿主染色體，并且無法在“野外”或注射到人體后進行復制。
本文將概述如何使用 QbD、縮小規模、超縮小規模 (USD) 和壓力測試等各種工具來加速 AAV 生物工藝的開發。我們還將總結當前可用于 AAV 表征和生物工藝質量控制的分析工具面臨的挑戰。
加速生物工藝開發的工具
隨著臨床管線的擴大，對 AAV 的需求正在迅速增長，這使得對平臺化大規模 AAV 生產工藝的需求比以往任何時候都更加迫切。它們的生產很復雜，需要細胞擴增、轉染、細胞培養、病毒收獲以及多個純化和緩沖液置換步驟。由于 AAV 固有的不穩定性和復雜的生物學特性，以及能夠告知要實現的理想產品屬性的長期臨床數據相對較少，因此開發和放大 AAV 生產工藝非常耗時且具有風險。它們的開發還建立在相對較少的先例之上，并且缺乏 AAV 特異性生物工藝、細胞系和分析儀器的技術成熟度優勢，而這些優勢在更成熟的平臺（如抗體）中已基本建立。隨著進一步的開發工作提高了單個 AAV 生產步驟的工藝強度，這些挑戰將繼續演變多年。
預計有幾種實驗工具能夠加速 AAV 產品制劑和早期工藝開發。這些建立在它們在單克隆抗體 (mAb) 開發方面取得的公認成功的基礎上，并且按大致的實施順序可包括：(i) 候選產品的可開發性篩選；(ii) 用于快速生物工藝開發的縮小和超縮小工具；(iii) 用于快速制劑的加速（強制）降解篩選。
這些工具中的每一個都被設計為在各自的開發階段使用，以加速可生產產品候選物的選擇，優化生產過程，或用于快速開發穩定的劑量配方。因此，可以提高效率，例如，通過設計可開發性篩選來生成生物物理數據，這些數據可以更好地為最終產品制劑和保持穩定產品的生物工藝參數操作窗口提供信息。mAb 的設計、生產和制劑逐漸集中在一些穩健的平臺方法上。這進一步限制了條件的搜索空間，并導致在用于這三種工具的許多實驗條件中出現更大的重疊。相比之下，AAV 的平臺生產方法還沒有足夠的時間來完全開發，因此，使用這三種工具測試的條件也在不斷發展。
有助于塑造用于加速 mAb 開發的工具的另一個特征是 QbD。通過了解工藝參數如何影響產品特性并最終影響其臨床性能，行業鼓勵采用這種方法來降低生物制品生產工藝開發和規模放大的風險。如圖 3 所示，該方法將關鍵質量屬性 (CQA) 定義為易于測量的生物物理和物理化學產品特性，以確保達到質量目標產品概況 (QTPP) 中定義的所需臨床性能；關鍵材料屬性 (CMA) 和關鍵工藝參數 (CPP) 被確定為可能會顯著影響 CQA 的因素，如果它們發生變化。因此，前面定義的三個實驗工具有可能識別 CMA 和 CPP，甚至量化它們的邊界。
圖 3. 質量源于設計 (QbD) 框架的工作流程。
mAb 的平臺生產方法和來自許多產品的大量臨床數據意味著現在可以相對快速地定義它們的 CQA。相比之下，隨著更多產品生成臨床數據，AAV 的 CQA 可能會繼續擴大。這也可能導致使用此處描述的三種工具進行測試和測量的條件范圍發生變化。
用于 AAV 生產生物工藝開發的規模縮小和超縮小工具
規?？s小的平臺使用與中試到大規模生產相同的工藝單元操作，并通過足夠嚴格的控制來實現高可再現性，但操作體積要小得多，通常可以并行運行，以快速探索和優化工藝變量。生產工藝的早期中試規模優化可在很大程度上提示 CMA 和 CPP 的可接受設計空間以及將它們維持在設計空間中的潛在控制策略。因此，可以將規?？s小的平臺擴展到對生物工藝操作參數的更廣泛探索，從而提供更深入的了解。
這種方法現在已經很好地用于 mAb 生物工藝開發，盡管產品之間也存在顯著差異，但某些方面可以很容易地轉移到 AAV 中。例如，ambr（Sartorius）等小型化生物反應器可以提供與大型生物反應器相當的細胞培養性能、環境控制性能和抗體生產率，使其適合作為大規模細胞培養/發酵的預測工具。使用 24 孔板的縮小方法已被用于優化懸浮培養中慢病毒載體的生產，因此具有成功生產 AAV 的良好潛力。
其它強大的規模縮小的系統，如微型層析柱和微升批次孵育，也被廣泛用作層析條件和填料選擇的高通量篩選方法。這些規?？s小的平臺已經在抗體領域建立了良好的基礎，并且已經被用于加速 AAV 生物工藝的開發。當然，AAV 的具體篩選條件會有所不同，甚至可能在血清型之間也會有所不同，如 AAV 陰離子交換層析的洗脫電導率和 pH 值等 CPP會影響空-完整衣殼分離性能。
與規模縮小相比，超縮?。║SD）工具不會復制小規模操作的工藝，而是旨在僅使用毫升樣品、精確模擬大規模工藝操作單元中遇到的臨界條件。它們可用于優化產品、溶液條件或生物工藝參數，并為每個操作單元定義 CPP 設計空間。特別是，它們可以提供 CPP 對產品 CQA 影響的因果理解，這對于 QbD 框架至關重要。
灌裝/完成和超濾/洗濾 (UF/DF) 步驟通常被發現是功能性 AAV 滴度損失的主要原因，因此 USD 可能用于確定這些損失的原因。這種損失被認為源于濃縮步驟中剪切誘導的病毒聚集。然而，雖然 UF/DF 和灌裝/完成步驟因泵和閥門中的微空化，是生物工藝中剪切應力的兩個主要來源，但需要進一步研究，以確認剪切應力是 AAV 損失的主要原因。治療性蛋白質就是這種情況，其中聚集不僅歸因于剪切應力，還在于暴露于氣-液界面或在層析純化步驟期間吸附到固體表面相結合，或者通過泵和閥門中的高剪切率引起的空化現象。此外，發現溶液的 pH 值和固-液界面的固體表面粗糙度會影響剪切應力下蛋白質聚集的程度。
最近的一項USD研究描述了 UF/DF 期間蛋白質濃度、剪切速率和跨膜壓力對濾液通量和 mAb 聚集的影響。與中試規模過濾實驗的比較表明，測試條件與濾液通量之間存在類似的相關性。發現增加的過濾時間和產品濃度與 USD 和中試規模 UF/DF 模型中的濁度增加相關，表明提高蛋白質濃度導致更頻繁的蛋白質碰撞、更高的聚集傾向以及相應更高的濁度。盡管兩個模型中的濾液通量之間有很好的一致性，但兩個模型之間剪切暴露程度的差異導致檢測到的濁度存在輕微差異。因此，需要進一步修改，以使 USD 更準確地模擬 UF/DF 中剪切應力的影響。在另一項研究中，USD 模型準確預測了離心過程中剪切應力對質粒 DNA 的影響。
迄今為止，USD 模型已經成功地模擬了許多生物制品的大規模生物工藝條件，包括質粒 DNA、單克隆抗體、腺病毒和細胞。然而，還沒有文獻報道使用 USD 模型來預測 AAV 在剪切應力下的行為。
原文：Z.Jiang, P.A.Dalby, Challenges in scaling up AAV-based gene therapy manufacturing. Trends in Biotechnology, 2023.
