細胞培養基的范圍從簡單的成分到復雜的化學成分明確的混合物。它們可能包含許多化學成分，每一種都具有獨特的特性，其中任何變化都可能影響細胞培養過程和正在生產的產品。雖然可以使用眾所周知的經典方法（例如傅里葉變換紅外光譜）輕松識別簡單物質，但在處理復雜混合物時，這變得更具挑戰性。
行業工藝正在得到改進，以確保良好的生產規范和控制措施到位。實現這一目標的一種方法是不再使用非化學限定的原材料。培養基用戶無法量化每種培養基成分，必須找到適合預期用途的技術并接受某些產品變化的受控風險。如果培養基的關鍵成分未知，則可能會使用次優來源或原材料，并可能導致批次損失。這可能代價高昂，并且會顯著影響進度和市場供應。
國際協調委員會的 Q7A 活性藥物成分良好生產規范指南要求生物制藥最終用戶除了使用供應商的分析證書，至少進行一種檢測，以確認每個批次材料的一致性。因此，許多最終用戶復制了培養基制造商執行的基本 ID 指紋測試，作為其內部質量控制流程的一部分。這種復制不會給培養基的指紋增加任何價值。
我們行業中的許多人都認識到主要挑戰包括：
缺乏指紋確認細胞培養基和相關原材料的標準指南。
目前的測試可能表明配方或質量屬性，但不表明過程影響/適合目的。
目前用于指紋識別培養基配方的 ID 方法很麻煩，并且通常需要不同的分析技術，例如，高效液相色譜。
我們在本文中描述的培養基指紋識別的三層方法可幫助您定義一種替代方法，該方法將允許驗證培養基質量和指紋識別。它可以幫助您根據原材料特性、培養基特性目標以及培養基制造商或用戶現場可用的資源，選擇合適的方法進行傳入 ID 測試。它基于避免重復測試的基本原則，使培養基用戶可以信任培養基制造商提供的數據。
圖 1：培養基指紋識別的三層測試方法。
在這種情況下：
培養基供應商有責任執行 1 級基本 (ID) 測試和一種 2 級定性指紋識別，以確認所提供培養基的身份/一致性或質量沒有差異。
建議最終用戶執行 2 級定性指紋識別，以增加材料表征的維度。該測試不應與培養基供應商完成的 2 級定性指紋識別相同。
根據材料的工藝知識和風險評估，可能需要對特定化合物進行 3 級定量指紋識別。這可以由供應合作伙伴作為附加服務執行，也可以由最終用戶直接執行，具體取決于資源和它們之間的關系。
下面，我們將描述測試方法中每個級別的期望。此目的是確認細胞培養基適用于目的，并且應用的指紋識別水平來自過程知識和要求。
級別 1：基本 (ID) 指紋識別
這被定義為能夠在總體水平上將一種培養基與另一種培養基區分開來。所描述的內容不會唯一地標識每個化學定義的培養基；相反，它可以區分培養基 A 和培養基 B。
物理化學測試方法通常用于基本 (ID) 指紋識別。這些都是簡單的技術，表明培養基已準確配制，整體組成沒有重大錯誤。
級別 2：定性指紋識別
該級別指紋識別包括各種快速且通常定性的方法。
光譜學，包括紅外 (IR)、拉曼、二維熒光和全反射 X 射線熒光與多變量數據分析相結合，通常被考慮在內。由于其較高的成本、復雜性和環境影響，色譜技術目前不常用于指紋識別。但是，也有使用液相色譜-質譜法 (LC-MS)/質譜法 (MS) 進行細胞培養基指紋識別的案例。隨著技術的發展，可以考慮更廣泛地使用色譜方法進行 2 級定性指紋分析。
光譜方法提供有關物質和單個分析物與電磁輻射相互作用方式的信息。這允許收集化合物或這些化合物的混合物的特定指紋。 IR 是最成熟的方法，其次是拉曼，兩者都表明它們適用于識別簡單的化合物。
已經開發出二維熒光并成功應用于指紋識別細胞培養基。它在復雜細胞培養基原材料指紋識別方面的潛力已在研究中得到證實，并已應用于細胞培養基表征。
這些方法都無法檢測復雜細胞培養基樣品中的所有化合物，但它們可以提供有關化合物的足夠信息以支持穩健的表征或 ID 方法。不幸的是，沒有明確的參考文獻庫提供每種方法可以涵蓋的分析物的具體范圍。此處提供的指南支持根據表征目標、材料樣品的特性或可用的專業知識來確定最合適的方法。
理論上，拉曼和紅外對大多數化學物質敏感；然而，這些方法僅足夠靈敏、以檢測培養基中以較高濃度存在的化合物，在大多數情況下，這些化合物主要是緩沖液和氨基酸。這些方法可能無法檢測到低水平的維生素或微量元素。
有關選擇光譜技術的決策圖表，請參見圖 2。
圖 2：選擇用于指紋識別細胞培養基的光譜技術的決策圖表。
IR 或拉曼光譜可用于對熒光團含量低且重點在于主要化合物的簡單或復雜樣品進行指紋識別。拉曼的一個優點是它可以通過包裝進行收集，并可用作測量粉末和液體的手持式儀器。然而，當用于粉末表征時，拉曼光譜對樣品中存在的各種多晶型物表現出敏感性。與拉曼一樣，IR 也可用于粉末，但對樣品的水分含量非常敏感，因此在處理吸濕性樣品時不推薦用于此應用。
全反射 X 射線熒光光譜 (TXRF) 可以補充紅外和拉曼光譜。它可以對已溶解的原材料中存在的痕量金屬進行定性分析。
級別 3：定量測試
當需要更廣泛的指紋識別或調查工作時，幾種方法可能會有用，包括色譜法或電感耦合等離子體質譜法 (ICP-MS)。以下是對其中一些技術的簡要說明。
元素指紋
ICP-MS 用于按質荷比分析樣品中的單個元素。通常將樣品酸化，然后引入儀器。形成氣溶膠并使用 ICP 形成原子離子，原子離子被移入質譜儀，按質量分離，然后移至檢測器。元素通過原子質量來識別，標準曲線用于量化目標元素。樣品的質譜可以用作與其它樣品的指紋進行比較。
TXRF 是一種分析工具，可用于對溶解的原料中檢測到的痕量元素進行定量分析。將內部標準品添加到樣品中并渦旋，將少量樣品移至玻璃盤上并干燥。樣品分析完成后，使用連接到 TXRF 儀器的專用軟件根據熒光輻射強度計算每個檢測到的元素的濃度。
除了分析液體樣品外，TXRF 還可以通過樣品的酸消解來分析固體樣品。它允許對分析樣品中存在的元素進行快速、直接的定性和質量比評估，僅微克樣品，不會因酸消解而發生化學變形，顯示其微量分析能力。
色譜法
色譜分離復雜樣品的成分，并與各種檢測器一起使用，以識別和量化可能以低濃度存在的分析物。高效或超高效液相色譜通常以反相模式用于分析水性或水溶性樣品。例如，色譜柱可以是基于反相的、尺寸排阻的、離子交換的或親和的。常見的檢測器選項包括紫外/可見光 (UV/VIS)、熒光、質譜、折射率、電導率和帶電氣溶膠。分析物可以衍生化以實現或增強檢測。離子色譜法可用于分析緩沖液和其它工藝液體。
通常，選擇具有適合分析物的色譜柱和檢測器的系統，開發方法（色譜柱、流動相、柱溫、樣品體積），并生成色譜圖。檢測峰并與標準曲線比較以量化目標分析物。將未知樣品的保留時間與已知參考標準進行比較，以確認樣品的身份。對于細胞培養基等復雜樣品，色譜圖還提供了樣品的“指紋”，可以與其它指紋進行比較，作為另一種識別方法。
如果使用 LC-MS，質譜會為指紋添加另一個維度。圖 3 描述了如何使用多變量數據分析將來自多個檢測器的方法用于經典的目標/定量指紋識別或非目標指紋識別。 UV/VIS 簡單且便宜，但在復雜混合物中可能會受到干擾，因為它不是很專一。
圖 3：用于細胞培養基指紋識別的色譜技術選擇決策圖。
結論
盡管細胞培養基指紋識別不可能有一種放之四海而皆準的方法，但這是一種“有一定適用性”的方法。它使培養基制造商/供應商和生物制藥最終用戶能夠更深入地了解他們的培養基和產品/工藝能力和要求，并將他們的精力集中在與材料相關的最重要的事情上。
