背景：切向流動(dòng)過濾 (Tangential flow filtration, TFF) 系統(tǒng)是一種廣泛應(yīng)用于灌流培養(yǎng)的細(xì)胞截留裝置，但操作時(shí)間長(zhǎng)帶來了巨大的挑戰(zhàn)。眾所周知的常見問題包括膜污染，這導(dǎo)致濾液流量減少以及產(chǎn)物滯留增加。此前實(shí)驗(yàn)對(duì)中空纖維中污染行為的影響進(jìn)行了研究，并發(fā)現(xiàn)交替式液流特性、細(xì)胞裂解、剪切應(yīng)力和膜孔徑的組合應(yīng)用是造成這一現(xiàn)象的主要因素。
結(jié)果：在這項(xiàng)工作中，使用基于磁懸浮泵的低剪切TFF系統(tǒng)、在小規(guī)模灌流生物反應(yīng)器(200 ml)中對(duì)不同的工藝設(shè)置和條件進(jìn)行了測(cè)試。利用產(chǎn)生重組單克隆抗體的CHO細(xì)胞系驗(yàn)證了一種新的概念，即利用兩個(gè)磁懸浮泵實(shí)現(xiàn)中空纖維的反向流動(dòng)。采用動(dòng)態(tài)再循環(huán)流量時(shí)，產(chǎn)品篩分效率可提高30%。此外，通過在短周期內(nèi)逆轉(zhuǎn)兩個(gè)交替泵的流量，實(shí)現(xiàn)了最小的產(chǎn)物截留率。此外，還發(fā)現(xiàn)了高分子量物質(zhì)透過膜進(jìn)入灌流工藝收獲液流與流動(dòng)方向和產(chǎn)物篩分程度之間的相關(guān)性。
結(jié)論：具有反向流動(dòng)的TFF是交替式切向流 (ATF) 系統(tǒng)的有價(jià)值的替代方案，以克服抗體截留，可以在各種規(guī)模和恒定的生物反應(yīng)器體積下使用。與ATF和TFF相比，產(chǎn)物收率和純度有差異，因此這是工藝設(shè)計(jì)的一個(gè)重要點(diǎn)。
連續(xù)強(qiáng)化生物工藝提供了在穩(wěn)態(tài)條件下長(zhǎng)期運(yùn)行的可能性，與傳統(tǒng)的補(bǔ)料分批工藝相比，具有更高的操作靈活性、更高的生產(chǎn)率以及更低的占地面積要求。直接集成高細(xì)胞密度灌流工藝和連續(xù)的下游捕獲步驟可以節(jié)省巨大的成本。然而，可靠的細(xì)胞截留裝置是灌流工藝的核心，必須在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)發(fā)揮作用，而不存在大量的產(chǎn)物截留或?yàn)V液中的顆粒突破，以允許持續(xù)收集目標(biāo)產(chǎn)物。
切向流過濾 (TFF) 技術(shù)使用循環(huán)裝置，通常是蠕動(dòng)泵，將細(xì)胞培養(yǎng)物平行于膜表面運(yùn)輸，產(chǎn)生液體剪切，以防止凝膠層在過濾器表面形成。然而，據(jù)報(bào)道，蠕動(dòng)泵會(huì)由于細(xì)胞上的高剪切應(yīng)力而增加細(xì)胞裂解，在這方面，磁懸浮泵為生物工藝處理中的低剪切、無脈沖和連續(xù)控制流量應(yīng)用提供了一種替代方案。泵葉輪懸浮在密封的外殼中，無接觸，由電機(jī)的磁場(chǎng)驅(qū)動(dòng)，產(chǎn)生連續(xù)、均勻的流動(dòng)，對(duì)細(xì)胞的剪切極低。交替式切向流(ATF) 系統(tǒng)是近年來越來越流行的單向TFF的替代方案，其使用隔膜泵在中空纖維中來回移動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)物。我們已經(jīng)討論過，這種反沖和中空纖維的再生可以獲得更好的產(chǎn)物回收率。
灌流滴度決定這一工藝的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)影響。中空纖維過濾系統(tǒng)是生物生產(chǎn)行業(yè)高密度灌流細(xì)胞培養(yǎng)中細(xì)胞截留的首選技術(shù)。然而，他們也存在一些問題，如易發(fā)生膜污染，從而降低了濾液的收率。TFF或ATF中的產(chǎn)品篩分問題直接影響產(chǎn)品的總收率。有時(shí)，中空纖維過濾器中的跨膜壓力 (TMP) 會(huì)受到影響，導(dǎo)致濾液流量減少，從而導(dǎo)致工藝提前終止。對(duì)于中空纖維是超濾的組件，這是很常見的情況。此外，從中空纖維過濾器篩出的產(chǎn)物量的變化會(huì)產(chǎn)生不穩(wěn)定的產(chǎn)品濃度，導(dǎo)致捕獲步驟與灌流工藝集成的復(fù)雜性增加。
大量的研究旨在確定膜污染的潛在原因，以制定克服產(chǎn)物截留的策略。在下游TFF工藝中，較高的剪切速率可以有利地延緩膜污染；相反，在細(xì)胞培養(yǎng)中，過大的剪切應(yīng)力(通過蠕動(dòng)泵)通常會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞活性降低，從而對(duì)產(chǎn)物的篩選產(chǎn)生負(fù)面影響。一些策略使用了大孔過濾器 (孔徑高達(dá)10 um，而不是用于微過濾的0.2 ~ 0.45 um) 和寬表面孔微濾膜，這樣可以防止亞微米顆粒通過更大的膜孔而避免造成不可逆的污染。在這些大孔過濾器的下游，需要一個(gè)額外的深層過濾步驟，以從濾液流中去除小顆粒。其它研究已經(jīng)證明，ATF是在重組蛋白生產(chǎn)中提高篩分效率的優(yōu)選方法，同時(shí)實(shí)現(xiàn)高細(xì)胞密度。研究還表明，在基于ATF的灌流培養(yǎng)中，具有定義的交替流范圍的優(yōu)化工藝操作可進(jìn)一步減少產(chǎn)物截留和柱堵塞。此外，對(duì)ATF和TFF灌流培養(yǎng)中膜污染機(jī)理模型的研究揭示了導(dǎo)致產(chǎn)物截留問題的濾餅形成理論，以及其它因素，如過濾器材質(zhì)、孔徑、消泡劑、剪切應(yīng)力和產(chǎn)物的聚集傾向。過濾器材質(zhì)和表面電荷的影響尚未得到廣泛研究。聚砜 (PS) 和聚醚砜 (PES) 材質(zhì)由于親水性而具有較低的蛋白結(jié)合性能。然而，PS可以促進(jìn)蛋白質(zhì)和裂解細(xì)胞之間的相互作用，因?yàn)樗懈叩呢?fù)電荷密度。因此，后者比由PES制成的中空纖維具有更高的產(chǎn)物截留。
除了嚴(yán)重的膜污染和由此產(chǎn)生的低產(chǎn)品篩分，細(xì)胞培養(yǎng)過程中蛋白質(zhì)聚集的存在也會(huì)大大降低產(chǎn)物收率。在溶液中，單克隆抗體經(jīng)常聚集到高分子量物種 (HMW)，這是一種由二聚體、三聚體或較大的寡聚體組成的聚集物子集。蛋白質(zhì)聚集取決于多種因素，包括蛋白質(zhì)組成、蛋白質(zhì)表達(dá)、工藝條件或穩(wěn)定性。HMWS的形成可能引起潛在的安全問題，如免疫原性，也可能對(duì)生產(chǎn)過程產(chǎn)生重大影響。高比例的高分子量物質(zhì)通常是不可取的，因?yàn)樗黾恿思兓邢叻肿恿课镔|(zhì)所需的工作 (例如增加純化步驟的數(shù)量)，從而導(dǎo)致下游工藝產(chǎn)量降低。因此，監(jiān)測(cè)和了解細(xì)胞培養(yǎng)過程中蛋白質(zhì)的聚集，特別是在集成的連續(xù)工藝中，是非常必要的。
在本研究中，與蠕動(dòng)泵相比，磁懸浮泵以更低的剪切來確保細(xì)胞懸浮液的循環(huán)，在TFF灌流培養(yǎng)中進(jìn)行了評(píng)估，目的是評(píng)估其在產(chǎn)物截留和對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)性能的影響方面的性能，如細(xì)胞活性、生長(zhǎng)速率、細(xì)胞特異性生產(chǎn)力。然后對(duì)經(jīng)典的TFF模式進(jìn)行了修改，得到了一個(gè)動(dòng)態(tài)的再循環(huán)流動(dòng)模式，隨著TMP在中空纖維過濾器上的“脈動(dòng)”，假設(shè)這可以減少可逆的膜污染，并對(duì)此進(jìn)行了量化。另一種克服產(chǎn)品篩分衰變的嘗試是通過應(yīng)用反向流 (rTFF)，在TFF的回流線上安裝第二個(gè)磁懸浮泵進(jìn)行研究。并與傳統(tǒng)交替式切向流過濾系統(tǒng)的篩分性能進(jìn)行了比較。在這些不同的操作模式下，對(duì)單克隆抗體單體和HMWS的分析進(jìn)行了研究。
詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)操作和結(jié)果以及分析，請(qǐng)參考原文。
圖1. (a)本研究中使用的灌流工藝設(shè)置。交替式切向流過濾 (ATF) 模式，使用市售XCell ATF2裝置，顯示隔膜泵外殼。切向流過濾 (TFF) 模式，通過中空纖維進(jìn)行單向流動(dòng)，通過外夾卡箍式流量傳感器在反饋回路中控制低剪切一次性泵。反向切向流過濾 (rTFF) 模式，應(yīng)用兩個(gè)磁懸浮泵，通過一個(gè)外夾卡箍式流量傳感器的反饋信號(hào)控制跨膜交替流動(dòng)。箭頭表示流動(dòng)方向 (TFF模式下為單向，ATF和rTFF模式下為雙向)。中空纖維濾液出口的泵用于控制收獲流量 (H)。(b) TFF靜態(tài)和動(dòng)態(tài)運(yùn)行。在靜態(tài)操作 (運(yùn)行#TFF1) 中，恒定的再循環(huán)流量會(huì)產(chǎn)生恒定的TMP (如果沒有或污染很小)。在動(dòng)態(tài)操作 (運(yùn)行#TFF2) 中，流量由階躍函數(shù)控制，從而產(chǎn)生脈動(dòng)TMP特性。
圖2. (a)活細(xì)胞濃度(左y軸)和活細(xì)胞活性 (右y軸)；(b) 細(xì)胞特異性生長(zhǎng)速率-u；(c) 灌流速率 (實(shí)心符號(hào))、收獲率 (半實(shí)心符號(hào)) 以及廢棄率 (沙漏符號(hào)) 以及(d) 細(xì)胞特異性灌流率-灌流培養(yǎng)中的cspr #ATF1 (灰色圓圈)、#TFF1(藍(lán)色方塊)和#TFF2(橙色菱形)。
圖3. (a) 生物反應(yīng)器中單克隆抗體(mAb)滴度；(b) 灌流收獲中的mAb滴度；(c) 細(xì)胞特異性生產(chǎn)力- qp和 (d) 灌流培養(yǎng)中產(chǎn)品篩分#ATF1(灰色圓圈)，#TFF1(藍(lán)色方塊)和#TFF2(橙色菱形)。通過收獲液中IgG濃度與生物反應(yīng)器中IgG濃度的比值來評(píng)估產(chǎn)物篩分。100%的比例表示沒有產(chǎn)品滯留。
圖4. (a)活細(xì)胞濃度(左y軸)和活細(xì)胞活性(右y軸)；(b)細(xì)胞特異性生長(zhǎng)速率-u (cl灌流率(實(shí)心符號(hào))，收獲率 (半實(shí)心符號(hào))以及廢棄率(沙漏符號(hào))和(d)細(xì)胞特異性灌流率-灌流培養(yǎng)中的cspr #ATF2(深灰色菱形)，#rTFF1(紅色方框)和#rTFF2(藍(lán)綠色六邊形)。
圖5. (a) 生物反應(yīng)器中的單抗滴度；(b)灌流收獲中的單抗滴度；(c)細(xì)胞特異性生產(chǎn)力-qp和(d)灌流培養(yǎng)中產(chǎn)物篩分 #ATF2 (深灰色菱形)，#rTFF1(紅色方框)和#rTFF2(藍(lán)綠色六邊形)。
圖6. 培養(yǎng)第15天，單抗細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器樣品 (綠色) 和灌流收獲 (藍(lán)色) 的SEC分析。CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清用普通SEC (TSKgel G300owXL)色譜柱分析。灌流培養(yǎng)的SEC色譜圖(a) #ATF1， (c) #TFF1和(e) #rTFF2。在生物反應(yīng)器中，單體和高分子量物種 (HMWS) 在第7天 (黑色) 和第15天 (灰色線) 的峰值，來自灌流運(yùn)行(b) #ATF1， (d) #TFF1和(f) #rTFF2的收獲樣品。
圖7. (a)單體峰的相對(duì)數(shù)量和(b)高分子量物種(HMWS)與生物反應(yīng)器總峰面積(實(shí)線)和灌流收獲(虛線)在灌流培養(yǎng)#ATF1(灰色圓圈)，#TFF1(藍(lán)色方塊)，#TFF2(橙色菱形)和#rTFF2(藍(lán)綠色六邊形)隨時(shí)間的關(guān)系。(c) 5種不同灌流培養(yǎng)物中IgG濃度(Cedex BioHT測(cè)定)與單體峰響應(yīng)(280 nm)之間的線性相關(guān)。
圖8. (a)生物反應(yīng)器穩(wěn)態(tài)階段和灌流收獲期間的平均(n5)單體分?jǐn)?shù)和(b) HMWS分?jǐn)?shù)與總峰面積的關(guān)系。誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。(c)產(chǎn)物篩分曲線與時(shí)間的關(guān)系;(d)產(chǎn)物篩分系數(shù)與灌流培養(yǎng)中收獲的HMWS總含量的關(guān)系#ATF1(灰色圓圈)、#TFF1(藍(lán)色方塊)、#TFF2(橙色菱形)和#rTFF2(藍(lán)綠色六邊形)。采用二次回歸法對(duì)兩組參數(shù)之間的關(guān)系進(jìn)行建模。
總結(jié)
利用磁懸浮泵，證明了低剪切TFF操作在小型灌流生物反應(yīng)器中連續(xù)生產(chǎn)抗體的適用性。我們利用磁懸浮泵對(duì)基于TFF的灌流培養(yǎng)中的產(chǎn)品篩分現(xiàn)象提供了兩種解決方案。通過在中空纖維上施加動(dòng)態(tài)再循環(huán)流，脈動(dòng)TMP比恒定的單向TFF流促進(jìn)了25%的產(chǎn)物通過。更值得注意的是，通過使用兩個(gè)磁懸浮泵(rTFF)在中空纖維上應(yīng)用反向流動(dòng)的新概念，顯示了TFF灌流細(xì)胞培養(yǎng)中產(chǎn)物截留現(xiàn)象的全面改善。在纖維的回流一側(cè)安裝第二個(gè)泵，從而使用正向和反向流，在整個(gè)過程中實(shí)現(xiàn)了接近100%的產(chǎn)物透過。在恒定剪切速率和循環(huán)剪切速率下，對(duì)不同的工藝設(shè)置進(jìn)行了性能測(cè)試。結(jié)果，細(xì)胞不受剪切應(yīng)力的影響，并在所有系統(tǒng)中表現(xiàn)出相似的生長(zhǎng)和生產(chǎn)行為，分別與剪切速率和操作模式 (ATF、(r)TFF)無關(guān)。與傳統(tǒng)ATF系統(tǒng)相比，這一應(yīng)用于TFF逆流的綜合解決方案產(chǎn)生了一個(gè)穩(wěn)健、易于建立和類似的灌流工藝，具有在恒定生物反應(yīng)器滯留體積下運(yùn)行的優(yōu)勢(shì)。
此外，數(shù)據(jù)表明，中空纖維灌流工藝過程中的膜污染不僅會(huì)影響產(chǎn)物的收率，還會(huì)影響產(chǎn)物的純度。綜上所述，單向TFF模式比動(dòng)態(tài)和反向TFF模式具有更大的截留率，從而導(dǎo)致更差的產(chǎn)物收率。因此，TFF工藝由于較低的HMW含量 (較高的抗體純度) 而產(chǎn)生較純的收獲流，但由于抗體截留在生物反應(yīng)器中而產(chǎn)生較低的產(chǎn)物收率。結(jié)果表明，在單向和雙向流動(dòng)中，灌流收獲的HMW雜質(zhì)量不同。與在TFF模式下相比，在ATF和rTFF模式下，收獲流中較高水平的蛋白質(zhì)雜質(zhì)對(duì)產(chǎn)物總收率的影響更大。因此，在交替式切向流過濾系統(tǒng)中獲得的較高產(chǎn)物收率并不同時(shí)導(dǎo)致較高的產(chǎn)物純度。因此，要處理的物料的純度會(huì)根據(jù)灌流工藝設(shè)置的不同而不同，因此對(duì)下游單元來說是一個(gè)挑戰(zhàn)?？梢栽诋a(chǎn)品篩分系數(shù)和HMWS水平之間建立相關(guān)性，以推斷來自不同設(shè)置的雜質(zhì)的程度。這為集成式連續(xù)生物工藝的操作提供了重要機(jī)會(huì)，其中可基于篩分系數(shù)使用此相關(guān)性來相應(yīng)地調(diào)整下游純化步驟。因此，可以實(shí)現(xiàn)一致的產(chǎn)物純度或聚體/HMW雜質(zhì)的分離。在考慮一個(gè)完全集成的連續(xù)工藝時(shí)，不同HMWS水平和物質(zhì)對(duì)純化工藝的影響仍然需要在未來的研究中加以考慮。
