在過去的四十年里，使用病毒載體進行基因治療的臨床試驗數(shù)量顯著增加。這段時間，有很多重大發(fā)現(xiàn)，也有很多挫折。盡管存在這些早期障礙，但該領域的深入研究仍在繼續(xù)，這些努力已推動許多基于病毒載體的療法獲得批準，許多其它療法目前正在進行后期臨床試驗。這些療法主要專注于治療不同的癌癥，少數(shù)專注于治療單基因、心血管和傳染病。在過去的 20 年中，已經批準了 20 多種基于病毒載體的療法，其中 7 種是基于腺病毒、腺相關和慢病毒載體的療法（原文發(fā)表時間為2022年1月）。
獲批的病毒載體療法
在 1990 年代初期，一種腺病毒載體被批準用于臨床試驗，是首批獲得批準的病毒載體之一。從那時起，一些腺病毒載體已被批準廣泛使用。“Gendicine”是第一個獲得批準的病毒載體技術，于 2003 年被中國食品藥品監(jiān)督管理局 (CFDA) 批準用于治療頭頸部鱗狀細胞癌患者。Gendicine 是一種重組腺病毒，可表達腫瘤抑制蛋白 p53。截至 2020 年，已有30,000 名患者接受了 Gendicine 的治療，當與化療、放療和其它常規(guī)治療結合使用時，觀察到的患者反應率顯著提高。將這種病毒系統(tǒng)與傳統(tǒng)治療相結合的臨床結果比單獨使用傳統(tǒng)治療更有效。許多癌性腫瘤是 p53 基因突變的結果，因此許多臨床研究目前正在進行中，Gendicine 用于治療其它類型的癌癥，包括乳腺癌、肝癌、胰腺癌和結直腸癌，正變得越來越普遍。另一種基于腺病毒載體的療法，稱為 Oncorine，于 2005 年獲得CFDA的批準。Oncorine 用于治療晚期難治性鼻咽癌，并且在與化學療法和放射療法結合使用時非常成功。由于 E2B 55K 區(qū)域的缺失，該載體只能在 p53 缺陷細胞中感染和復制，導致這些細胞的溶瘤效果。
AAV 載體此前沒有像腺病毒載體那樣被深入研究，然而，它們自 1960 年代被發(fā)現(xiàn)以來已經獲得極大成功。已經批準了三種基于 AAV 載體的治療方法，其中兩種仍在市場上。Glybera 是一種基于 AAV 載體的療法，于 2012 年獲得歐洲醫(yī)療機構的批準。Glybera 向脂蛋白脂肪酶缺乏的患者提供脂蛋白脂肪酶。盡管這種療法能夠有效地治療該疾病，但在市場上提供該療法在經濟上是不可行的，因為這種疾病的發(fā)病率是百萬分之一，因此在 2017 年停止使用。Luxturna 是另一種 AAV 載體療法，于 2017 年在美國獲得 FDA 批準。它適用于患有稱為 Lebers 先天性黑蒙的遺傳性視網(wǎng)膜疾病的患者，這種疾病會導致進行性失明。Luxturna 也是一種非常昂貴的治療方法（每只眼睛 425,000 美元）。然而，由于更多的人受到 Lebers 先天性黑蒙的影響，該產品一直留在市場上。另一種成功的 AAV 載體療法更加昂貴，即Zolgensma，用于治療脊髓性肌萎縮癥患者。該療法通過遞送運動神經元存活轉基因來取代患者體內的非功能基因。它于 2019 年獲得 FDA 批準，并且已經看到患者改善到可以無支撐行走的程度，這在這種治療出現(xiàn)之前是不可能的。
與 AAV 載體類似，慢病毒載體的研究時間不及其它載體系統(tǒng)，但從 2003 年首次用于臨床試驗開始，它們就非常成功。Kymriah 于 2017 年被FDA 批準用于治療小兒復發(fā)性 B 細胞急性淋巴細胞白血病。Kymriah 是第一個基于慢病毒載體的基因療法以及第一個嵌合抗原受體 (CAR) T 細胞免疫療法。這種腫瘤療法允許對患者自身的 T 細胞進行離體基因工程修飾，使其能夠識別和消除 CD19 陽性細胞。這是一種非常成功的治療方法，淋巴細胞白血病患者在治療后的很長一段時間內都達到了緩解。Yescarta 是另一種使用 CAR T 細胞免疫療法治療成人復發(fā)性 B 細胞淋巴瘤的慢病毒載體技術。Yescarta 于 2017 年獲得 FDA 批準，在治療這種疾病方面非常有效。
臨床試驗中的病毒載體療法
在過去的四十年中，已經有超過 3000 項批準、正在進行或完成的臨床試驗涉及使用病毒載體進行基因治療。隨著基因治療領域的持續(xù)研究成功，正在研究的疾病范圍已經顯著擴大。許多不同類型癌癥的基因治療臨床試驗目前正在進行中，包括頭頸癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、肝細胞癌和黑色素瘤。還研究了許多單基因疾病，包括 SCID-X1、ADA-SCID、粘多糖貯積癥和Fanconi貧血，以及 HIV 和最近的 COVID-19 等傳染病。逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒和慢病毒載體占 3000 項臨床試驗的一半以上，如前所述，它們已轉化為已上市的批準治療方法。從目前臨床試驗數(shù)據(jù)的趨勢來看，可以推斷出基于病毒載體的基因治療未來的發(fā)展方向（圖 2）。
圖 2. 1989 年至 2021 年進行的、涉及逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關和慢病毒載體（分別為 a-d）的體內和體外臨床試驗。
在 1990 年代，逆轉錄病毒載體是臨床試驗中最常用的病毒載體，用于治療多種疾病，包括不同的腫瘤類型、單基因疾病和 HIV（圖 2a）。盡管 30 年前是最流行的病毒載體選擇，但逆轉錄病毒載體的使用一直在穩(wěn)步下降。這種現(xiàn)象很可能是由于它不能用于非分裂細胞以及插入腫瘤發(fā)生的風險，導致癌細胞形成。盡管使用逆轉錄病毒載體完成了 536 項臨床試驗。一種名為 Strimvelis 的治療方法已上市，但已被下市。Strimvelis 于 2016 年被歐洲藥品管理局批準用于治療 ADA-SCID，使用逆轉錄病毒載體通過離體遞送將腺苷遞送至患者的細胞。然而，Orchard Therapeutics 報道了 2020 年患者發(fā)生白血病的事件，該公司已停止治療，直到風險因素得到更好的了解并可以減輕。目前正在意大利進行一項針對 50 名患者的觀察性臨床跟蹤研究，該研究將進行至少 15 年。為了使逆轉錄病毒載體在未來獲得更大的應用，需要對插入誘變的機制和提高安全性的方法進行更多的研究。
在所有病毒載體中，腺病毒載體最常用于臨床試驗，有 573 個已獲批準、正在進行或已完成的項目（圖 2b）。目前市場上有兩種用于腫瘤治療的療法，另外兩種在后期臨床試驗中，腺病毒載體研究和基因治療方法取得了相當大的成功。70% 的臨床試驗用于腫瘤治療，腺病毒載體已成為全球腫瘤基因治療中最流行的病毒載體。腺病毒載體因其高免疫原性而成為腫瘤治療的熱門選擇。雖然在其它情況下無益，但誘導強烈的促炎反應對腫瘤治療非常有利。然而，與逆轉錄病毒載體一樣，腺病毒載體的使用在過去十年中有所下降。這可能是因為它們缺乏對晚期臨床試驗的轉化，以及在基因治療臨床試驗中使用腺相關病毒和慢病毒載體的增加。
與其它載體系統(tǒng)相比，腺相關病毒載體已用于一定數(shù)量的臨床試驗，并取得了相當程度的臨床成功。在過去的十年中，兩種基于 AAV 載體的療法進入市場，且 I 期和 II 期臨床試驗的數(shù)量急劇增加（圖 2c）。盡管許多 AAV 載體 I 期試驗沒有像其它載體試驗那樣早開始，但截至 2021 年，已擁有最多的 III 期試驗獲批、正在進行或完成項目（圖 2c）。AAV 載體還在一系列疾病中顯示出臨床療效，包括抗胰蛋白酶缺乏癥、眼部疾病和血友病。看到 AAV 載體僅在過去 20 年取得的進步，它們似乎是針對未來使用的有前途的技術。在審查臨床試驗數(shù)據(jù)時，另一項有前途的技術是慢病毒載體。慢病毒載體在過去十年中獲得批準、正在進行或完成的臨床試驗數(shù)量最多，盡管在 2010 年之前數(shù)量最少（圖 2d）。慢病毒載體應用主要關注的一些疾病包括腫瘤、β-地中海貧血、艾滋病毒和范可尼貧血。使用慢病毒載體而不是逆轉錄病毒載體進行轉基因傳遞的好處是它們可以轉導緩慢分裂或非分裂的細胞，并且似乎對整合到致癌位點的親和力較低，尤其是自我失活的第三代慢病毒載體。這些具有強啟動子的慢病毒載體在很大程度上降低了插入誘變的風險，然而，這種風險并沒有完全消除。一種自滅活慢病毒載體已用于治療 HIV 的臨床試驗，共有 65 名患者接受了該載體治療，并且在載體輸注后 8 年以上未報告任何不良事件。分析過去三十年有限數(shù)量的不良事件和成功的臨床試驗數(shù)據(jù)表明，AAV 和慢病毒載體都是未來有利的基因治療技術。
基于病毒載體的基因治療面臨的擔憂
盡管它們在基因治療臨床試驗中取得了越來越大的成功，但病毒載體技術仍然需要克服許多問題才能被接受為廣泛的治療選擇。使用病毒載體的關鍵挑戰(zhàn)是在體內遞送時誘導免疫反應、確定所需的最佳治療劑量、生產成本以及轉基因表達水平的精確調節(jié)。
免疫反應
病毒載體的免疫原性既可以通過免疫反應隨時間的大小進行定量測量，也可以通過觸發(fā)的免疫反應類型進行定性測量。許多因素決定了載體的免疫原性，并且根據(jù)病毒載體系統(tǒng)的結構而有很大差異。在進入臨床試驗之前了解載體與免疫系統(tǒng)的相互作用至關重要，因為注射后發(fā)生嚴重的免疫反應會導致許多嚴重的并發(fā)癥，在某些情況下甚至會導致死亡
腺病毒和腺相關病毒載體尤其受到免疫方面的關注。不同腺病毒血清型的流行因地區(qū)而異。例如，血清型 5 (Ad5) 在美國的流行率為 50%，但在非洲，這一比例接近 100% [56]。盡管存在這些差異，但腺病毒通常在環(huán)境中普遍存在并且具有高度免疫原性，這在使用相同血清型施用載體時可能會引起關注。如果患者已經暴露于治療載體中使用的血清型，這可能會導致強烈的免疫反應，其特征是預先存在的中和抗體快速流入注射部位，從而減少治療劑量并限制載體發(fā)揮其臨床效果的能力，并由于補體激活和由此引起的炎癥引起患者的安全問題。這與 AAV 的情況類似，因為全世界大約 80% 的人口已經接觸過某種 AAV 血清型。以前接觸血清型被證明是腺病毒和 AAV 載體臨床試驗中需要克服的主要障礙。然而，在某些情況下，高免疫原性載體可能有益于治療某些疾病。腺病毒載體是最常見的癌癥治療載體，主要是因為它們具有高度免疫原性。通過溶瘤腺病毒治療觸發(fā)抗腫瘤反應已被證明在市場上兩種批準的癌癥治療方法中取得了一些成功。
與腺病毒載體相比，慢病毒載體具有非常有利的免疫原性特征，這是它們在過去十年中成為流行載體選擇的一個主要原因。人類的慢病毒感染非常有限，因此，只有一小部分人會攜帶預先存在的病毒抗體。此外，在許多慢病毒載體系統(tǒng)中，水皰性口炎病毒囊膜糖蛋白 (VSV-G) 的原始病毒囊膜已被替換。慢病毒載體觸發(fā)持久的 T 細胞免疫，不會引起不利的載體特異性免疫或炎癥反應，從而有利于臨床應用。
生產成本
如果最終目標是臨床應用，則生產病毒載體的成本是一個重要的考慮因素。病毒載體系統(tǒng)的生產需要考慮許多成本，包括設備、實驗室材料、純化、儲存和所需的勞動力。以基于 AAV 載體的基因療法 Glybera 為例，如果該產品生產成本太高且受該疾病影響的患者數(shù)量太少，該產品留在市場上可能在經濟上不可行。載體生產成本的一個主要因素是一名患者所需的劑量。例如，較低的接種劑量可以抵消較大的生產成本。降低生產大量載體的成本和時間的一種方法是使載體具有高滴度水平。腺病毒載體在基因遞送方面非常有效，這些載體的滴度非常高，這在大規(guī)模生產時是有益的。腺病毒載體是一種非常受歡迎的疫苗接種選擇，其高滴度特性是其受歡迎的部分原因。總的來說，生產病毒載體的成本是一個重大障礙，如果它們要在商業(yè)規(guī)模上使用，就必須克服這個障礙。目前有很多研究致力于簡化載體生產過程，以降低生產所需的成本和時間，并允許在資源匱乏的地區(qū)進行生產。
轉基因的表達
使用病毒載體的另一個考慮因素是轉基因的遞送以及這個過程可以控制到什么程度。將特定基因遞送至細胞的能力已被證明是一種非常有效的治療方法，但是，如果這不以規(guī)范的方式發(fā)生，則可能對患者有害，尤其是在隨機整合的情況下。轉基因表達有時似乎是不可預測的，研究表明在某些情況下遺傳變異會影響表達。根據(jù)條件，轉基因需要在不同的水平上表達，并且可能僅在特定區(qū)域或細胞類型中表達。為了控制轉基因的表達和對抗不可預測性，已經實施了諸如使用組織特異性啟動子和自我失活的策略。組織特異性啟動子將轉基因的表達限制在某些細胞類型中，從而限制了廣泛的表達。當在治療上用于靶向特定細胞或組織類型并避免在非靶細胞或組織中表達時，這是理想的。此外，如在第三代慢病毒載體中所見，已納入自我失活機制。3'LTR的修飾阻止了一輪整合后的繼續(xù)表達，有效地允許轉基因表達的量通過載體的劑量來控制。盡管取得了這些積極成果，但仍需要進一步研究，以實現(xiàn)嚴格調控的轉基因表達。
結論
在過去的二十年里，基于病毒載體的基因療法取得了非常令人鼓舞的進展，這表明這種療法在醫(yī)學上有著積極的前景。據(jù) IQVIA 報道，2021 年上半年，風險投資公司對生物制藥公司的投資創(chuàng)歷史新高，其中細胞和基因療法吸引了大量投資。2021 年醫(yī)藥并購 (M&A) 的價值與前一年相比顯著增長，其中許多是基于病毒載體和基因治療的交易。雖然這些對于病毒載體使用的未來來說是有希望的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，但這種基因治療方法所面臨的問題仍然存在，并且需要大量的研究來克服這些問題。展望未來，考慮到臨床試驗數(shù)據(jù)和每種病毒載體的缺點，慢病毒和腺相關病毒載體似乎是未來重點研究的最有利選擇。由于不良反應有限且免疫原性良好，這些病毒載體有可能成為現(xiàn)代醫(yī)學的關鍵治療方法。
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原文：A.L.G.Mahoney, N.T.Nassif, B.A.O’Brien, et al., Viral Vectors in Gene Therapy and Clinical Applications. Molecular Cloning, 2022.
