rAAV 的生產是一個復雜的生物過程
重組腺相關病毒 (rAAV) 已成為體內基因治療的首選載體。這些載體可用于轉導哺乳動物細胞，從而實現穩定的游離基因維持和轉基因表達。重組 AAV 是一種無復制能力的病毒載體，可通過以下幾種方法之一產生：昆蟲細胞的桿狀病毒轉導、哺乳動物細胞基于輔助病毒（如單純皰疹病毒）的轉染以及或哺乳動物細胞的三質粒瞬時轉染。最近，穩定的生產細胞系變得更加受人關注，例如 CEVEC/Cytiva 的 ELEVECTA 平臺，因為這些平臺具有可放大性并減少了質粒 DNA 等昂貴原材料的需求量。此外，也存在質粒 DNA 的替代品：“狗骨”DNA (dbDNA) 是一種合成 DNA 載體，使用酶促 DNA 制造工藝生產，完全不需要微生物培養。
使用質粒 DNA 對懸浮馴化的 HEK293 細胞進行三質粒瞬時轉染是生產 AAV 的最常用方法之一。此過程不依賴于輔助病毒，質粒 (pHelper) 提供必要的輔助元件。目的基因位于兩個反向末端重復 (ITR) 序列 (pGOI) 和提供復制和衣殼蛋白 (pRepCap) 的第三個質粒之間的單獨質粒上。HEK293 細胞系由于易于培養和轉染而被廣泛使用，它也是一種表征良好的細胞系，自 1977 年細胞系永生化以來一直用于生產重組蛋白。HEK293 細胞還穩定表達腺病毒 E1A 和E1B，兩者都是 AAV 復制所必需的。
轉染試劑，如聚乙烯亞胺 (PEI) ，有助于質粒進入細胞。PEI 與質粒 DNA 形成復合物，并在與細胞孵育期間通過靜電相互作用與細胞膜結合。這些復合物然后通過胞吞作用以核內體的形式內化。核內體必須通過微管相互作用通過細胞骨架網絡，避免溶酶體降解，直到質粒 DNA 從核內體逃逸到細胞質中，然后必須通過核孔復合體 (NPC) 進入細胞核。DNA 進入細胞核取決于細胞周期，有人建議接近 M 期的轉染是理想的，因為核膜破裂可以增加質粒進入細胞核。
三質粒瞬時轉染的優化工作已實現了收獲后滴度增加，但對于全身給藥藥物的生產，目前的滴度仍然不夠，因為可能需要超過 10^15vg/患者的劑量。最簡單的方法是擴大生產規模，以滿足行業需求，但這會對本已昂貴的療法的商品成本產生巨大影響。在轉染優化之前可以采取一些步驟來優化生產過程，其中最基本的是選擇和開發合適的細胞系。細胞系選擇將決定貼壁或懸浮培養細胞的上游工藝。一旦選擇，就可以進行進一步的開發，例如對高性能克隆的克隆篩選。細胞系工程也可用于敲入或敲除特定基因以提高細胞系性能。質粒工程也可以在這一點上進行，以增加生產的完整衣殼的比例。質粒工程的潛在目標可能包括修改 ITR 以增加完整的目的基因 (GOI) 包裹，或修改 Rep 蛋白以嘗試增加 GOI 的基因組復制和包裝。
基于 HEK293 的系統的一個關鍵挑戰是確保正確轉染。據報道，只有 5-10% 的細胞似乎會產生可測量水平的 AAV 衣殼，這表明確保將每種質粒轉染到每個細胞中可能是一個需要克服的障礙。這也可能是由抗病毒和炎癥反應的誘導引起的，據報道這是對宿主細胞中 rAAV 產生的反應，通過降低或消除細胞對病毒產生的反應能力來影響這些途徑也可能提供增加病毒滴度的機會。在細胞培養物中添加小分子抑制劑可以實現這一點，盡管可能需要在下游工藝 (DSP) 過程中去除這些小分子、或通過細胞系工程來敲除或敲低相關通路時產生問題。
隨著規模的增加，轉染過程變得更具挑戰性，由于病毒載體生產設施越來越頻繁地設計為大于或等于 2000 L 的規模，這一點變得越來越重要。
DoE 與 OFAT 方法
優化轉染的一個關鍵步驟是確定過程中的關鍵因素。從轉染試劑、質粒、細胞系和復合介質等原材料，到復合時間、質粒比例和所用 DNA 總量等因素，這些因素各不相同。在更大的規模下，其它因素開始發揮作用，例如轉染混合物在反應容器內的分散所需的時間和效率。在初始工藝開發活動中可能不會考慮這些因素，因為這些工作通常以小得多的量進行。它們還會受到反應器形狀、體積以及葉輪形狀和速度等變量的影響。
如上所述，影響 rAAV 生產轉染效率的因素有很多。一個常見的優化過程是一次修改一個因素 (OFAT) - 但是，這這沒有考慮正在研究的因素之間的相互作用。Zhao等報道，OFAT 方法提高了某一血清型 rAAV 的產量，但在生產其它血清型時未觀察到這種增加。
實驗設計 (DoE) 是一種已成功用于優化整個生物技術行業流程的方法。DoE 允許對指定輸出的多個相互依賴的因素進行評估。2020年，Zhao 等人首次報道了使用 DoE 優化 AAV 載體生產。質粒比率、總 DNA 濃度和細胞密度在 52 種不同條件下同時變化，導致 13 種不同衣殼變體的平均純化后產量超過 1×10^14 vg/L。諸如此類的結果可以用作進入管線的新項目或產品的優秀基準，因此在這些情況下，減少工藝開發可能是可以接受的，而無需從第一原則開始重復完整的 DoE 流程。
使用 DoE 優化轉染通常會涉及幾輪實驗。第一輪可能會查看更大范圍的幾個變量，例如轉染時的活細胞密度、DNA 濃度、轉染試劑：DNA 比率、轉染體積和復合物形成的孵育時間。在此之后，可能會進行另一個 DoE 以進一步細化這些因素，或者可能會引入新的變量，例如質粒比率。在引入新的原材料、評估新的轉染試劑或使用新的細胞系時，有必要重復這些 DoE。
近年來，已經投入了更多資源來了解 AAV 生產的基本原理，包括野生型和重組型。已經有文章回顧了生產 AAV 的 HEK293 細胞的蛋白質組學，并有文章總結了 AAV 產生的細胞途徑和動力學，以及通過三質粒轉染 HEK293 細胞開發 rAAV 生產的機制模型。這種對細胞過程和動力學的更深入理解允許更有針對性的工藝優化。這方面的一個例子是利用 PEI 介導的質粒 DNA 傳遞的機制模型，該模型表明只有 5% 的質粒輸入進入細胞，而進入細胞核的量甚至更小，約為 0.6%。這些數字可能因細胞系和轉染試劑而異，但確實提供了在嘗試優化瞬時表達工藝中最關鍵的部分時需要克服的障礙。
優化轉染是關鍵步驟，但不是唯一步驟
使用基于質粒的瞬時表達系統時，優化的轉染工藝對于確保最佳產量、質量和一致性至關重要。將所有必需的質粒 DNA 輸送到細胞核的過程是成功開發高產生產平臺的基礎。
為了最大限度地提高生產率，還需要評估其它因素。這些范圍從細胞系開發、細胞系的組學評估以確定基因敲除或敲低的目標，以及質粒工程以最大化完整衣殼，到生產過程中的培養基成分和補液策略以優化細胞健康和生產力。所有這些因素和許多其它因素都有助于生產過程足以滿足當前一代基因療法開發的需要。
原文：P. Boyce, Transfection optimization for AAV production. Cell & Gene Therapy Insights 2023; 9(3), 305–309.
