基于桿狀病毒的 AAV 生產
盡管已上市的第一個 AAV 基因治療產品 uniQure 的 Glybera (alipogene tiparvovec) 是使用桿狀病毒系統生產的，但該平臺主要針對治療性蛋白質的生產進行了優化。行業已經開發了一種 BEVS 生產系統，用于生產規模為 21,000 L 的含有流感血凝素的疫苗。與基于 HEK293 的方法相比，桿狀病毒介導的 AAV 生產還不太成熟，盡管大約在二十年前就已首次引入，但臨床上的產品較少。與 AAV 等病毒載體相比，單一重組蛋白的生產復雜性較低，而對于前者，五種蛋白質（VP1、VP2、VP3、Rep78 和 Rep52）和單鏈 DNA 分子必須以最佳水平表達并正確組裝。
最佳 AAV 生產需要將哺乳動物病毒 (AAV) 分子翻譯到培養的昆蟲細胞中。AAV 需要剪接才能正確表達其 VP1、VP2 和 VP3 衣殼蛋白及其 Rep78 和 Rep52 亞型。遺傳序列已經進化以確保最佳剪接并隨后AAV結構成分在哺乳動物細胞中的正確化學計量。不幸的是，這些過程并沒有在昆蟲細胞中以最佳方式發生，除其它外，天然存在的病毒啟動子需要被在桿狀病毒感染細胞中具有活性的啟動子取代。因此，需要進行分子修補，以確保生產完全包裝且有效的 AAV 顆粒。如果不對病毒基因進行適當的分子工程、以符合昆蟲細胞表達，所產生的病毒將呈現不正確的衣殼化學計量（通常存在過多的 VP1），并且完整衣殼的百分比將會很低。圖 3 中的示意圖描述了迄今為止不同代的桿狀病毒生產系統。
圖 3：基于桿狀病毒的 AAV 生產系統的歷史示意圖，第一個系統于 2002 年推出，其中包含三種桿狀病毒，分別包含目的轉基因、cap 基因和 rep 基因。cap 基因置于桿狀病毒多角體蛋白 (polH) 啟動子的控制之下。rep 同種型 Rep52 和 Rep78 在 polH 啟動子 (Rep52) 和 Orgyia pseudotsugata (OpMNPV) (Rep78) 的 Δ 立即早期 1 啟動子的控制下分成兩個獨立的表達盒。第二代系統通過 Smith和Chen等人描述的策略將 cap 和 rep 結合在單個桿狀病毒中。后來，Galibert 等人開發了一個 Monobac 系統，在單個桿狀病毒中包含所有三個元素（cap、rep 和轉基因）。Aslanidi等人后來開發了穩定表達 cap 和 rep 基因的 Sf9 源性包裝細胞系。使用這些系統生產 AAV 只需要感染一種表達轉基因的桿狀病毒。
在第一代 BEVS 中，rep 轉錄本在不同啟動子的控制下被分成兩個盒，并且 cap 編碼序列被改變，以包含一個非規范的起始密碼子（ACG 而不是 AUG），以實現正確的 AAV 衣殼化學計量和基因組包裝。基因改變的 AAV 序列被克隆到三個單獨的桿狀病毒構建體中，這些構建體含有 cap、rep 或兩側為 AAV ITR 的轉基因。為了有效地生產 AAV，單個細胞需要同時感染三種不同的桿狀病毒。雖然該“Three-Bac”系統成功應用于重組AAV血清型1的生產，但無法應用于其它AAV血清型的生產。
第二代 BEVS 克服了 AAV 血清型的限制，并將 AAV 生產所需的桿狀病毒數量減少到兩種：攜帶 cap 和 rep 基因的 Bac–CapRep 病毒和攜帶 AAV DNA 基因組的 Bac–Transgene。此外，引入了不同的分子適應性，以實現 AAV 基因的正確表達。例如，Kondratov 等人使用衰減 Kozak 序列和漏核糖體掃描來實現 AAV5 和 AAV9 衣殼蛋白的正確化學計量。該團隊重新設計的 AAV 載體比 HEK293 生產的載體表現出更高的生物學效能。
確保正確的 AAV 化學計量 - 從而以高產量生產有效載體的另一種策略是在 AAV 序列中插入人工內含子。Chen等鑒定了一個桿狀病毒源性的內含子，他們在其中放置了桿狀病毒多角體蛋白 (polh) 啟動子。將人工內含子引入 (AAV) rep 和 cap 基因，以增強轉錄，從而增強 VP2/3 和 Rep52 的表達水平。由此產生的 AAV（各種血清型）具有傳染性且滴度高（高達 10^14 vg/L）。
BEVS 系統的最新發展包括將 AAV 生產所需的重組桿狀病毒數量進一步減少到只有一種重組病毒。Galibert等人通過將所有三個 AAV 基因（rep、cap 和側翼為 AAV ITR 的轉基因）插入一個“Monobac”桿狀病毒中來實現這一點。Aslanidi等人制備了桿狀病毒感染誘導型草地貪夜蛾 (Sf9) 包裝細胞系，細胞基因組中含有 AAV rep 和 cap 基因。用兩側攜帶有 AAV ITR 的轉基因的單個桿狀病毒感染該包裝細胞系，導致產生比第一代 Three-Bac 系統更高產量的 AAV 顆粒。
如果不對 AAV 基因進行適當的分子工程、以符合昆蟲細胞表達，則產生的病毒將具有不正確的衣殼化學計量和較低百分比的完整衣殼。此外，不正確的 Rep52 和 Rep78 表達時間和水平將導致在 AAV 衣殼中包裝更多殘留（宿主和桿狀病毒）DNA。因此，在表征桿狀病毒生產系統的 AAV 顆粒時，了解使用哪種特定表達系統始終很重要。這極大地影響了 AAV 載體的特性，例如傳染性、效力、包裝和可生產性。
與 BEVS 相關的 AAV 生產的另一個挑戰是桿狀病毒載體本身固有的遺傳不穩定性。桿狀病毒在病毒復制過程中自然切除其部分基因組，以形成突變病毒，這些病毒可能成為有缺陷的干擾顆粒。在后續需要擴大規模的細胞培養傳代過程中，這些突變體的生長速度可能超過具有全長基因組的桿狀病毒。
與 AAV 基因表達和剪接不當一樣，分子工程可以在很大程度上克服桿狀病毒遺傳不穩定性。通過刪除某些基因或通過將轉基因插入基因組中特定的穩定位點，可以使桿狀病毒基因組更加穩定。此類策略尚未針對 AAV 表達進行充分探索。一旦桿狀病毒載體和 AAV 基因的分子設計得到優化，生物生產商將受益于 BEVS 平臺的許多積極特性，以大規模、穩健地生產 GMP 級生物藥。
原文：F.Hoeksema, H.van der Schaar, P.Puri, et al., Large-Scale AAV Production: Advantages of an Insect-Cell Baculovirus Expression Vector Platform. Bioprocess Insider, 2023.
