使用病毒載體作為多種應用（如疫苗、癌癥治療或基因療法）的治療產品一直呈指數增長。因此，需要改進生產工藝，來應對臨床試驗和最終商業化所需的大量功能性顆粒。親和層析 (AC) 可用于簡化純化工藝并生成具有高滴度和純度的臨床級產品。然而，使用 AC 純化慢病毒載體 (LV) 的主要挑戰之一是將高度特異性的配基與溫和的洗脫條件相結合，以確保保持載體生物活性。在這項工作中，我們首次報告了 AC 填料的使用，以特異性純化 VSV-G 假型 LV。配基篩選后，評估和優化了不同的關鍵工藝參數。測定了每毫升填料 1 × 10^11 總顆粒的動態載量，發現小規模純化工藝的平均回收率為 45%。建立的 AC的穩健性通過提供 54% 感染性顆粒收率的中間規模測試得到證實，這證明了 AC 基質的可放大性和可重復性。總的來說，這項工作通過提供一種純化技術來提高下游工藝效率，該技術可以一步實現高純度、可放大性和工藝強化，從而有助于縮短上市時間。
慢病毒載體 (LV) 是逆轉錄病毒科的一個復雜亞類，已成為細胞和基因治療中最常用的遞送工具之一。人們對 LV 越來越感興趣主要是因為它們能夠轉導增殖和非增殖細胞、整合和遞送長期基因表達，以及與 γ 逆轉錄病毒載體相比提供更安全的整合特性。這種囊膜病毒作為一種多功能工具脫穎而出，因為它可用于治療傳染病或遺傳性疾病，甚至可以用于制備針對腫瘤免疫療法的嵌合抗原受體 (CAR)-T 細胞。在可用的幾種囊膜中，水泡性口炎病毒 (VSV-G) 的 G 蛋白最常用于開發研究或臨床應用，因為它具有廣泛的嗜性和相對較高的穩定性。用臨床相關的糖蛋白替代天然囊膜蛋白，即假型，是 LV 的另一個屬性。值得注意的是，在市場上已有的 20 多種細胞和基因產品列表中，有 7 種是基于 LV 的療法，證明了這種病毒載體的成功。盡管體外或體內應用的治療劑量沒有嚴格標準化的值，但大多數研究報告的病毒劑量在每位患者 10^10 到 10^12 之間。對 LV 日益增長的興趣突顯了當前下游工藝 (DSP) 的瓶頸。
LV 以其生物學復雜性而聞名，因為病毒穩定性會受到溫度、離子強度、pH、凍融循環和剪切應力的影響。盡管在過去幾年中取得了重大改進，但 LV 的生產和純化遠未發揮其最大潛力。目前，生產平臺無法滿足臨床需求，從而加強了對穩健、可放大且具有成本效益的工藝的需求，以支持新的、基于 LV 的療法的商業。 LV 的下游工藝包括幾個操作單元，其中主要目標包括病毒的濃縮和純化，同時保持生物活性。病毒捕獲可能是 LV 純化過程中最具挑戰性的操作步驟之一，因此，已經研究了不同的層析模式，作為克服低回收率的替代方法。親和層析 (AC) 探索固定配基與目標產物之間的高選擇性和可逆相互作用，一步提供高純度、高倍數濃縮和可放大性。這種穩健的模式可以產生經濟效益，因為它通過減少單元操作的數量來提高工藝標準化和簡化。
因此，已經有文獻描述了使用親和層析純化 LV 的不同方法。固定化金屬親和層析 (IMAC) 涉及帶有組氨酸標簽 (his-tag) 的囊膜蛋白工程，提供了一種低成本且高度穩定的解決方案。然而，對導致病毒失活的苛刻解吸劑（例如咪唑或 EDTA）或在進一步臨床應用中可能產生的不利影響（例如蛋白酶、組氨酸標簽配基、金屬離子泄漏）的擔憂一直是一個主要缺點。另一種囊膜親和標簽策略是將生物素表達到 LV 表面，以便用固定化鏈霉親和素進行捕獲。最近，Mekkaoui 等人還描述了用 cTag8 標記的 RDPro 假型 LV 的純化。其中生物素模擬物是基因編碼的，并且與假型無關。此外，肝素親和性可能是另一項有吸引力的技術，因為它成本低廉，且洗脫步驟溫和，有助于病毒穩定性。然而，缺乏選擇性會導致 DNA 和宿主細胞蛋白 (HCP) 共洗脫。此外，大多數商業化肝素配基都來自動物，這給臨床應用帶來了一些限制，因為原材料的可追溯性和驗證可能具有挑戰性。因此，這突出了對親和層析步驟的需求，該步驟可以使用與囊膜病毒載體的生物活性相容的溫和洗脫條件提供高特異性和可放大性。
近年來，已經有多項研究報道了重組駱駝來源單域抗體片段 (VHH) 用于多種生物制藥，例如不同的 AAV 血清型；最近，Moleirinho (2020) 等人使用類似的技術開發了用于去除桿狀病毒的負模式 AC。由于體積小、特異性高、洗脫條件溫和且不含動物源性成分，VHH 配基可以作為一種替代方法來減輕親和方法中的一些問題。
在這項工作中，成功建立了第一個特異性結合到 VSV-G 假型 LV 的親和基質設計。首先，通過噬菌體展示產生的一組配基，在溫和條件下篩選病毒特異性和洗脫效率。使用功能測定法對主要候選物進行評估，以確定最佳表現者。此外，還對主要候選物的關鍵工藝參數進行了評估和優化。之后，確定了不同規模下已建立的 Lenti VSVG 親和基質的全部性能。最后，用新型親和基質純化的 LV 在雜質去除和質量屬性方面進行了表征。
詳細實驗操作、結果和討論，請參考原文。
圖 1. 使用生物素-配基偶聯物的 LV 結合反應。包含相對響應 (RU) 與時間 (s) 的 代表性SPR 傳感圖。在 VSVG-LV 和新型配基之間觀察到的三種不同的相互作用特征由配基 A、B、E 和 AAVX 配基的陰性對照說明。對于每個配基，通過改變注射的 VSVG-LV 原料的稀釋度（從 10 倍到 160 倍的倍比稀釋）獲得不同的結合反應。顏色代碼：藍色代表10倍稀釋，綠色代表20倍稀釋，黃色代表40倍稀釋，紅色代表80倍稀釋，灰色代表160倍稀釋。實線表示使用點到 Strep G Senseye 生物傳感器芯片上的最大生物素化 VHH 片段濃度 (20 μg/mL) 進行的實驗，而虛線表示使用的最小濃度 (0.02 μg/mL)。
圖 2. 使用生物素-配基偶聯物的 LV 釋放效率。不同解吸緩沖液，包括氯化鈉 (A)、氯化鈣 (B) 和精氨酸 (C) 對通過 SPR 測定評估的候選配基的洗脫效率 (%) 的影響。緩沖液洗脫優化包括三個濃度。(D) 使用中間精氨酸濃度 0.5 M，在四個 pH 值（8.0、7.5、7.0 和 6.0）下研究洗脫 pH 值對洗脫效率 (%) 的影響。
圖 3. 先導親和配基候選物選擇。(A) 使用生物素化配基功能化的鏈霉親和素瓊脂糖基球進行吸附介質篩選（A 至 E）。不同配基之間轉導單元的消耗（藍色條）和洗脫（黃色條）比較。AAVX 配基作為陰性對照。(B) 在最高配基密度 (++++) 下，轉導單元在 A、B 和 E 吸附介質原型之間的回收率比較。配基密度對配基 B 的影響被評估，因為它被證明是領先的候選物。配基密度從評估的最低 (+) 到最高 (++++) 值排序。顏色代碼：綠色陰影的四個條對應配基 A 的不同配基密度，橙色對應配基 B，紫色條對應配基 E。
表 1. 為建立新型親和填料而探索的基質的特性。
圖 4. 新型親和吸附介質的工藝參數優化。(A) 比較不同保留時間（1、2 和 4 分鐘）的 VSVG-LV 回收率結果。對于每種情況，估計病毒回收和病毒損失。(B) Lenti VSVG 親和基質的穿透曲線表示。澄清的 VSVG-LV 以 72 cm/h 的流速上樣到 1 mL 填充床中。C 是流穿樣品中病毒總顆粒的濃度，C0 是原料的病毒濃度，C0/C 比率由藍點表示。虛線表示 95% 置信區間。通過檢測 p24 蛋白來估計總顆粒濃度。
圖 5. 用于慢病毒載體純化的新型親和層析的評估。(A) 使用 1 mL 規模和 2 分鐘保留時間的 Lenti VSVG 親和基質純化 VSVG-LV 的色譜圖（頂部）和使用抗 p24 抗體檢測（底部）的流穿、洗脫和淋洗餾分的 Western blot信號趨勢。藍線和黃線分別代表 280 nm 和 260 nm 處的吸光度。(B) VSVG 親和填料在 1 mL 規模下的純化性能。TU 回收率 (%) 代表每個重復 (n = 3)。
表 2. 使用新型 Lenti VSVG 親和基質進行的中等規模（10 mL 填料）純化工藝的 LV 質量評估。
圖 6. 純化的 VSVG-LV 的規模放大和表征。(A) 10 mL 規模的 VSVG-LV 純化。該圖表示每個重復 (n = 3) 的 TU 收率 (%)。虛線顯示從 1 mL 規模獲得的平均回收率 (45 ± 10%)。(B) VSVG-LV 初始樣品（左圖）和使用 Lenti VSVG 親和基質純化后的樣品（右圖）的 TEM 分析。(C) 電泳圖表示分子量標記（灰線）、澄清的 VSVG-LV 樣品（黑線），以及使用帶有 LIF 檢測器的 CE-SDS 使用 Lenti VSVG 親和基質（綠線）純化的 VSVG-LV。圖中顯示了主要的 VSVG-LV 蛋白質。
總結
如今，由于基因治療以及基于細胞的產品在個性化醫療方面的巨大潛力，對它們的需求正在快速增長。關于基于 LV 的療法，由于缺乏簡單且可放大的純化工藝序列，下游工藝仍然具有挑戰性。本文描述了一種基于 CaptureSelect? 技術的新型親和基質的發現和實施，該技術首次實現了使用 VSV-G 囊膜假型化 LV 的捕獲。與現有技術相比，新型吸附介質實現了具有競爭力的收率和雜質清除率。在這項工作中取得的結果證明了這種新型吸附介質的適用性，它提供了高選擇性、高純度、可放大性以及溫和的洗脫條件。這些特性使 Lenti VSVG 親和基質成為傳統 AEX 層析的可靠替代品。此外，實現的高效純化和工藝簡化可以縮短上市時間，并為應對大規模 LV 純化的挑戰開辟新的可能性。
原文：A.S.Moreira, S.Bezemer, T.Q.Fria, et al., Implementation of Novel Affinity Ligand for Lentiviral Vector Purification. International Journal of Molecular Sciences, 2023.
