本文是來自Ambrx, Inc. 和3M的研究人員發表的文章“Single-stage chromatographic clarification of Chinese Hamster Ovary cell harvest reduces cost of protein production”的內容簡介，詳細內容，請參考原文。
使用一次性層析澄清裝置 (CCD) 開發了單級澄清，以從中國倉鼠卵巢 (CHO) 收獲細胞培養液 (HCCF) 中回收重組蛋白。 CHO HCCF 的澄清是一個復雜且昂貴的過程，涉及多個離心和/或深層過濾步驟，以去除細胞和碎片并減少工藝相關雜質，例如宿主細胞蛋白 (HCP)、核酸和脂質。使用深層過濾時，過濾器鏈由多個不同比例、層數、孔徑和吸附特性的過濾器組成。深層過濾器與 0.2 微米膜過濾器相結合，基于尺寸排阻、吸附和基于電荷的機制澄清 HCCF，并提供強大的生物負荷控制。澄清過程的每個階段都需要時間、勞動力和公用設施，每一步都會有產品損失。在這里，使用 3M Harvest RC Chromatographic Clarifier（一種單級 CCD）被確定為三級過濾系列的替代策略。 CCD 導致總體過濾面積更小，沖洗體積更小，收率更高。使用生物工藝成本模型，將單級澄清工藝與三級過濾工藝進行了比較。通過將 CHO HCCF 澄清壓縮到單級層析，澄清工藝的總成本降低了 17%-30%，具體取決于生物反應器規模。成本降低的主要驅動因素是總過濾面積、勞動力、時間和公用設施的減少。單級收獲工藝的優勢延伸到整個下游工藝，導致累積收率相對增加 25%，雜質清除率相當。
治療性蛋白質，包括單克隆抗體 (mAb)、雙特異性抗體、細胞因子和酶，通常使用補料分批或灌流哺乳動物細胞培養工藝生產，其中目標蛋白質由細胞表達和分泌。使用離心和/或深層過濾作為主要回收步驟從收獲細胞培養液 (HCCF) 中回收目標蛋白，以去除細胞和細胞碎片，并減少工藝相關雜質，如宿主細胞蛋白、核酸、和脂質。
使用離心或深層過濾是一個特定于產品的決定，其中生產的規模和臨床階段（例如，I期或商業化）、資本設備、成本、可清潔性和設施（專用或多產品）等因素是經過考慮的。與連續流離心相比，深層過濾單元操作的開發沒有那么復雜，這轉化為可預測的放大和易用性。支持早期生產的多產品設施，如合同開發和制造組織 (CDMO)，依靠一次性深層過濾作為主要澄清步驟，最終提高設施的靈活性、產能和生產力。此外，與離心分離相比，一次性深層過濾顯著減少了清潔驗證要求以及因產品轉換而導致的設施停機時間。
在中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞表達的重組非抗體蛋白產品的 1 期臨床生產工藝的開發過程中，開發了一種基線、兩級深層過濾工藝，以從細胞培養液（CCF)中回收目標蛋白 (圖 1A)。經過一系列正交層析分離，包括陽離子交換（CEX）、混合模式陰離子交換（MAX）、混合模式交換（MCX）、聚乙二醇化和進一步純化，藥物底物 (DS) 中殘留的宿主細胞蛋白（HCP）水平約為 200 ng HCP/mg 產品。使用沉淀助劑、洗滌緩沖液添加物、填料篩選（疏水相互作用層析 (HIC)、陰離子交換 (AEX)、陽離子交換 (CEX) 和混合模式 (MM)）探索了其它 HCP 降低策略，結果幾乎沒有進一步減少 HCP 的效果。
基于 AEX 纖維層析技術的一次性澄清裝置（3M Emphaze AEX Hybrid Purifier）作為 HCCF 澄清系列的第三級引入，導致 HCP 水平額外降低 50%（圖 1B）。初級、二級和三級澄清階段串聯操作，正面表面積比為 3:3:1。純化和聚乙二醇化后，在藥物物質 (DS) 中測得的 HCP 水平約為 10 ng HCP/mg 產品，表明層析澄清階段相對于兩級深層過濾系列提供了額外的 1.3 LRV。
最近，出現了一種新的解決方案，它采用纖維層析法高效且可放大地去除細胞、細胞碎片和關鍵的可溶性污染物。 3M Harvest RC Chromatographic Clarifier是一種單級層析澄清裝置 (CCD)，由 AEX 季銨 (Q) 配體功能化聚丙烯纖維床和 0.2 um 膜組成。在細胞培養澄清過程中，細胞和細胞碎片靜電結合到 AEX 纖維上，從而有效保留大顆粒和小顆粒，而不會形成表面餅層。與離心或傳統深層過濾相比，帶電纖維介質還能夠有效去除與可溶性工藝相關的雜質（即宿主細胞蛋白質和核酸），從而產生更清潔的流出物。 CCD 的推薦工作壓差為 ≤5 psi，從而減少細胞剪切和裂解，進一步提高 HCCF 的質量并最大限度地減少二硫化物還原的可能性。此外，與傳統的濕法深層過濾介質相比，CCD 的合成 AEX 介質在使用前需要更少的沖洗，從而節省了公用設施和時間。此外，水用作 CCD 沖洗液，因此無需緩沖液制備和相關緩沖液批記錄的質量放行。
考慮到使用三級鏈有效澄清和去除 HCP 和 DNA，開發了單級澄清作為直接替代，利用 CCD 的物理和靜電特性有效去除細胞、HCP 和 DNA（圖 1C）?；谶@些結果，細胞培養澄清步驟所需的總過濾面積減少了 2.5 倍。純化和聚乙二醇化后，整個工藝過程的產量增加了約 25%，同時所有產品質量屬性均符合驗收標準，并與三級過濾器鏈相當。
對細胞培養澄清步驟的生產成本進行建模，以使用三級與單級澄清方法的所有相關輸入來評估成本和節省。通過將 CHO 細胞培養的澄清壓縮到一級，澄清工藝的總成本降低了 17%-30%，具體取決于規模（例如，生物反應器體積）。成本降低的主要驅動因素是總過濾面積、勞動力和公用設施使用量的減少。隨著單級層析澄清工藝的實施，細胞培養澄清的總時間，包括準備（纖維床沖洗和平衡）、產品過濾和洗滌，減少了大約 50%。
詳細試驗操作、結果和討論，請參考原文。
圖 1. 生產非抗體蛋白產品的工藝流程。 (a) 使用 3M Zeta Plus Filter Capsules 10SPO2A 和 90ZBO5A 進行兩級深層過濾，(b) 使用 Zeta Plus Filter Capsules 10SPO2A 和 9OZBO5A 以及 3M Emphaze AEX Hybrid Purifier進行三級過濾，以及 (C) 單級層析澄清使用 3M Harvest RC Chromatographic Clarifier。澄清后，所有鏈均通過相同的下游純化單元操作進行處理：結合-洗脫陽離子交換層析、流穿混合模式陰離子交換層析、結合-洗脫混合模式陽離子交換層析、聚乙二醇化以及結合-洗脫陽離子交換層析。
圖 2. 3M Harvest RC Chromatographic Clarifier經過 SEM 制備步驟（例如固定、脫水、臨界點干燥和金濺射涂層）后的掃描電子顯微鏡 (SEM) 圖像。在澄清前 (a,b) 和 HCCF 澄清后 (c, d) 從裝置中提取纖維介質層。 (a) 和 (c) 中的紅色框分別表示 (b) 和 (d) 的放大圖像。
圖 3. (a) 鏈1-4 HCCF 的非還原 SDS-PAGE。 (b) 鏈 1-4 的 HCCF 的宿主細胞蛋白 (HCP) 分析。
圖 4. 三級過濾（鏈 3）和使用 3M Harvest RC Chromatographic Clarifier（鏈5）的單級層析澄清的壓差曲線。
圖5. 鏈2、鏈3和鏈5的細胞培養起始材料以及澄清濾液樣品的濁度(NTU)值(未酸化和酸化)。
圖6. 來自不同收獲策略（鏈1-5）的 (a) 宿主細胞蛋白 (HCP) 水平和 (b) 工藝中間體的累積產量。
圖7. (a) 單次運行不同體積生物反應器時，單級澄清 (鏈 5) 與三級澄清 (鏈 3) 相比節省的運行成本 (過濾器、人工、水和管路) 節省百分比。(b) 總費用節約，包括資本設備 (操作費用和過濾器支架)，與不同生物反應器體積下批次數的關系。
圖8. 不同生物反應器體積下單級和三級澄清工藝純化原料藥每克標準化成本 (數據歸一化為200L三級澄清)。
總結
將澄清單元操作壓縮到單級 CCD 可降低細胞培養澄清步驟的成本，減少與工藝相關的雜質（HCP 和 DNA），并提高生產率。單次運行的運營成本節省減少了 17-30%，具體取決于生物反應器規模?？紤]到資本設備的成本，200 L和 2000 L生物反應器在 100 個批次后的總體成本節約分別為 29% 和 19%。在細胞培養澄清階段（鏈3和鏈5）增加的 HCP 減少量減少了層析單元操作的負擔，并在工藝過程結束時轉化為更低的 HCP 水平。層析澄清（鏈3和鏈5）導致兩個工藝的 HCP 水平（10 ng HCP/mg 產品）完全符合規格（低于 100 ng HCP/mg 產品）。通過強化細胞培養澄清步驟，與三級工藝相比，總體相對收率增加了 25%。因此，每克純化原料藥的澄清步驟成本降低了 40%。單級 CCD 已成功放大用于 GMP 生產，并產生與實驗室規模相當的收率和 HCP 水平。
原文：B.O'Mara, N.K.Singh, A. Menendez., Single-stage chromatographic clarification of Chinese Hamster Ovary cell harvest reduces cost of protein production. Biotechnology Progress, 2023.
