摘要
關鍵詞：疫苗接種，佐劑，現代技術，未來展望。
疫苗接種無疑是人類歷史上最顯著的健康成就之一。在短短的兩個多世紀，疫苗使我們能夠實現不同尋常的目標，例如徹底消滅天花，在世界大部分地區消滅小兒麻痹癥，以及在一些國家大幅度降低許多傳染病的死亡率和發病率。在世界上許多地方疫苗接種政策是公共衛生的基石，安全有效的疫苗受到人們極大的關注。疫苗的效力不僅取決于抗原成分，還取決于佐劑，其以一種更有效的方式刺激免疫系統。佐劑被定義為添加到疫苗中的成分，以改善對抗原的免疫反應。此外，佐劑有幾個優點，如減少每劑疫苗的抗原量和疫苗接種次數，在某些情況下，它們增加抗原成分的穩定性，延長其半衰期并間接提高其免疫原性?，F有許多不同類型的佐劑用于疫苗生產（表1）。
表1 根據佐劑的主要作用機制分類
佐劑根據不同的標準進行分組，例如它們的物理化學性質、來源和作用機制。最受關注的分類系統之一是基于其作用機制，將其分為兩大類:遞送系統(顆粒)和免疫增強劑。另一類佐劑是粘膜佐劑，這是一組與前面的佐劑具有某些特征的化合物。在遞送系統佐劑中，抗原與佐劑相結合，特別是作為抗原載體。此外，它們能夠通過激活先天免疫系統誘導局部促炎反應，導致免疫細胞募集到免疫部位。確切地說，抗原-佐劑復合物通過病原體相關分子模式(PAMPs)激活模式識別受體(PRR)途徑。這引起先天免疫細胞的激活，伴隨有細胞因子和趨化因子的產生。同樣的途徑被免疫增強劑直接激活（圖1）。
圖1 佐劑的作用機制
添加佐劑對老年人使用的疫苗特別有效，因為這類受試者會出現免疫衰老的生理現象，它在自然感染或人工刺激(接種疫苗)后導致免疫反應減弱。在這種情況下，佐劑的存在可使疫苗克服這一限制。而且，佐劑對亞單位疫苗特別有用，因為亞單位疫苗通常免疫原性弱，無法單獨刺激強烈的免疫反應。然而，并非所有疫苗都需要佐劑。例如獲得認證的腦膜炎球菌結合疫苗不含佐劑，因為與蛋白質載體的結合本身能夠刺激良好的免疫反應。表2列出了目前認證的佐劑疫苗。
表2 當前通過FDA和EMA認證的人用佐劑疫苗
如表所示，目前絕大多數由EMA和FDA批準的人用疫苗都包括鋁鹽佐劑。鑒于這些佐劑是疫苗配方中使用最早的佐劑，為了提高疫苗的安全性和有效性，增加新佐劑的數量是絕對必要的，因此，有必要加強對具有佐劑特性的新分子和因子的研究，增加體外和體內研究的數量。與此同時，由于佐劑的使用和研究、新細胞底物的使用或工藝變更或轉移申請方面的監管挑戰，新產品的批準可能會受到延遲和提高成本。這方面可能成為抑制新奇事物、增加成本和延遲疫苗適用性的障礙，特別是在資源匱乏的國家。
此外，2019冠狀病毒病大流行凸顯了獲得有效疫苗以應對新的大流行潛在威脅的重要性。事實上，COVID-19的RNA疫苗具有內在佐劑特性，其與編碼RNA載體的脂質體成分相關。然而，最新認證的COVID-19疫苗是基于含有刺突蛋白的經典平臺，并添加了一種名為Matrix-M的新佐劑，該佐劑含有皂角提取物的成分A和C。
在選擇疫苗佐劑時需要考慮很多方面，其中安全性是第一位。一種好的佐劑必須是安全的，耐受性好，易于生產的；具有良好的藥學特性(pH值、滲透壓、內毒素水平等)以及保質期長；最后，在經濟上可行。在不影響佐劑安全性的前提下兼顧所有這些特性是很困難的。因此，目前使用的疫苗中佐劑應用較少。
盡管疫苗取得了巨大的成就，但近幾十年來，人們對這些產品產生了許多擔憂。一種反對疫苗的文化即“疫苗猶豫”已在世界范圍內蔓延。2019冠狀病毒病(COVID-19)大流行刺激了“疫苗猶豫”，它一方面表明了疫苗接種作為抵抗傳染病基本武器的重要性，但另一方面也凸顯了一部分人的猶豫行為。許多研究已報道了造成這種態度的幾個原因，但許多研究表明，最主要的原因是疫苗副作用的恐懼和疫苗組成的不信任，特別是佐劑是一種比其他成分更能引起公眾關注的成分。事實上，疫苗的副作用通常是輕微和短暫的，其通常表現為注射部位的局部疼痛和紅斑，輕微的全身不適和流感樣癥狀，這些影響通常在接種疫苗幾小時或幾天后消失，很少有過敏反應或其他嚴重副作用的病例報道。
這篇綜述評價了當前使用的疫苗佐劑，評估正在進行關于佐劑的特性和未來可能使用的研究，強調科學文獻中存在的潛在問題和副作用的依據。
2.1 礦物鹽
鋁鹽
20世紀20年代發現了鋁鹽的佐劑特性，1926年人們開始用這些化合物作為疫苗佐劑。最初考慮在培養基中添加鋁鹽，以便誘導破傷風和白喉抗原的沉淀，從而幫助其純化。然而，其結果表明，鋁沉淀抗原比可溶性抗原具有更強的免疫原性。因此，鋁鹽是使用時間最長和最常用的佐劑，目前認證的疫苗中約有三分之一含有鋁。因此，鋁鹽是疫苗佐劑中安全性測試最多的佐劑。
人類通過不同的途徑接觸到鋁，尤其是食物和空氣。它主要通過消化道和呼吸道被人體吸收，隨后進行擴散，然后經過三步排除過程，可是這一過程永遠不會完成。低于3%的吸入鋁和1%的攝入鋁擴散到整個生物體。然而，在人體中發現95%的鋁通過受污染的食物攝入的。世界衛生組織(WHO)規定通過食物攝入鋁的最高水平應為1mg/kg/d(成人為60至70mg/d)。最后，鋁包含在腸外溶液內，因此，通過注射擴散到血液和各種體液區室，在這種情況下，為了避免鋁的積累，其在靜脈注射溶液中的濃度應<25g/L。
鋁一旦被生物體吸收，在人體組織中擴散。大部分金屬儲存在骨骼、肝臟、肺和神經系統中。對于患有慢性腎病的人來說，鋁不能被清除，并隨著時間的推移而積累，尤其是在骨骼和神經系統中積累。在這類病人中高水平的鋁會沉積在大腦中引起腦病。在大鼠體內注射同位素鋁-26 (26Al)后其精確地量化了鋁對大腦的滲透。在生理條件下，鋁的腦滲透被量化為每克腦組織的0.001%～0.005%，這與給藥途徑和化學形式無關。2010年Goullé等量化了人組織中鋁水平，其應用電感耦合等離子體與質譜檢測相結合的技術對20例已故患者進行分析，這些患者以前沒有接觸過金屬，也沒有接受過任何含鋁或其他微量礦物質的治療，以濕重表示的中位數結果如下:肺=0.47g/g，腦=0.19g/g，肝臟=0.15g/g，心臟=0.10g/g，肌肉=0.08g/g和腎臟=0.06g/g。
鋁主要通過泌尿系統被生物體緩慢排出。有些鋁會永久沉積在人體內，其含量會隨著接觸程度和年齡的增加而增加。在成年人體內永久沉積鋁的量約為30～50mg。
在疫苗中鋁以結晶氫氧化鋁(AlH)復雜聚合物或無定形羥磷酸鋁(AlP)的簇狀納米顆粒形式存在。AlH呈針狀納米顆粒(?20nm)，而AlP在透射電鏡下呈網狀。這兩種形式通常溶于檸檬酸鹽，但AlP比AlH更易溶解?？乖ㄟ^靜電相互作用和配體交換吸附到佐劑顆粒表面。鋁鹽抗原結合增強抗原提呈細胞(APCs)對抗原的攝取和提呈。而且，鋁鹽刺激NLRP3炎癥小體的作用，導致IL-1β和IL-18的產生，引起局部炎癥和APCs的募集。
許多疫苗是抗原吸附在AlH或AlP上(例如，白喉和破傷風疫苗、無細胞百日咳疫苗、乙型肝炎疫苗以及肺炎球菌和腦膜炎球菌疫苗)。因為它們的免疫原性弱，需要增強免疫反應，以便引起有效的疫苗接種。在歐洲，《歐洲藥典》規定疫苗中的鋁含量最高不超過1.25mg/劑。在美國，《美國聯邦法規》規定生物制品(包括疫苗)中的鋁含量為0.85mg/劑。鋁主要以可溶性檸檬酸鹽或氯化物鹽的形式存在于食物中，而無機鋁化合物的佐劑是難溶的，這是佐劑作用方式的一部分。因此，由于鋁在生理pH值下的溶解度較差，肌肉注射或皮下注射后疫苗中鋁的吸收率預計會非常慢。
為了評估肌肉注射后鋁的動力學，Flarend等人進行了一些體內研究，通過肌肉注射26Al標記的AlH和AlP，其總鋁劑量為0.85 mg，實驗28天內AlH吸收率為17%，AlP吸收率為51%。26Al的最大血清濃度(Cmax)是2μg/L，即家兔鋁的正常值(30μg/L)為7%?；谶@些結果，肌內注射鋁鹽疫苗佐劑后鋁Cmax的預期增加量為0.04μg/L，即平均血鋁水平5 μg/L的0.8%。在本試驗中，大腦中的鋁水平濃度在10 - 8～10 - 7mg/g之間，即10?5～10?4μg/g，因此<0.0001μg/g，這比人腦中0.2μg/g的平均濃度低2000多倍。此外，一些研究評估了注射檸檬酸26Al后人體內鋁的排泄情況。一項相當古老的研究表明，靜脈注射26檸檬酸鋁后，59%的注射劑量在一天內隨尿排出，隨后幾天排出速度變慢(第5天平均滯留率為27%)，而最近的一項研究表明，在注射鋁劑8年后，殘留率約為2%。
鋁的毒性僅次于體液和組織中增加的金屬水平。特別是當腎功能受損時，這種增加是排除它的能力而改變的。尤其血液透析的腎功能衰竭患者具有較高的鋁水平，伴隨可能的神經毒性風險。腎移植能夠解決鋁的過剩，并可能解決相關的神經毒性。多年來，科學家們一直在爭論神經退行性疾病可能是鋁致神經毒性，到目前為止，還沒有確鑿的證據表明，這一作用仍然存在爭議。
鋁的神經毒性已在體外、離體和體內動物模型和人體中進行了研究。在體外對細菌進行了一些研究，顯示鋁不存在致突變性，此外，使用對氧化誘變劑敏感的菌株后，對鋁的氧化作用模式產生了疑問。在體外對細胞系進行了研究，以評估不同形式的鋁可能的遺傳毒性。研究人員在細胞系進行評估不同形式的鋁可能引起的遺傳毒性。一些科學家使用多個供體的淋巴細胞在動物模型中進行胚胎毒性研究，最后，在體內進行各種研究。在這些研究中最常用的技術是彗星試驗和微核試驗。有趣的是，研究結果往往不一致和相互矛盾，這可能存在方法上的缺陷。因此，到目前為止，盡管鋁鹽能夠產生或多或少強烈的氧化應激，但仍不能肯定地說(在推薦劑量下)用作佐劑的鋁鹽會有毒性作用。
2.2 乳劑
這一類重要佐劑的前身是完全和不完全的弗氏佐劑。這兩種佐劑都是油包水乳劑，其能夠提呈抗原并刺激先天免疫系統。在其構造中完全弗氏佐劑(CFA)包括熱殺死的分枝桿菌，它增強了刺激免疫反應，目前其誘導小鼠強烈的免疫激活和自身免疫(如葡萄膜炎和實驗性自身免疫性腦脊髓炎)。然而，CFA能夠引起強烈的和持久的局部炎癥，這可能導致動物明顯的疼痛，并可能在注射部位發生潰瘍。不完全弗氏佐劑(IFA)不含分枝桿菌，在20世紀50年代被用作人流感疫苗的佐劑，與無佐劑的相同疫苗相比，它可以誘導更強、更持久的抗體反應。IFA的佐劑活性是基于油性抗原沉積的特征，抗原在注射部位持續釋放，這同時導致抗原壽命的增加以及強烈的局部先天免疫刺激，伴隨吞噬、白細胞募集和浸潤以及細胞因子的產生。然而，IFA的強烈副作用，疫苗配方中應用IFA及其人類的常規使用受到阻礙。特別是，毒性是含量高的非生物降解的廢油以及它們的品質差引起的。2005年WHO進行的一項調查顯示，大約100萬名IFA患者進行免疫接種后出現了嚴重的副作用，例如在4萬名接種疫苗的人中出現了無菌膿腫。
2.2.1 MF59
MF59是一種油包水乳劑，其由角鯊烯、Span 85和Tween 80組成，其溶解于pH 6.5的10 mM檸檬酸鈉緩沖液，平均粒徑約為165 nm。這是1997年意大利批準的第一種用作人類疫苗的水包油乳劑。它目前用于三價和四價(TIV和QIV)流感疫苗Fluad (Seqirus)，這些疫苗最初僅用于65歲以上的人群，但后來被批準用于其他流感風險群體如幼兒和嬰兒，并在H1N1大流行疫苗期間用于孕婦和幼兒。研究表明：MF59的存在可提高2歲以下兒童流感疫苗的有效性。MF59還作為HBV疫苗的佐劑進行了測試，其能夠引起強烈的免疫反應，而且比鋁誘導的免疫反應更好。MF59的作用機理與鋁鹽相似。注射部位的儲存狀況幾乎可以忽略不計，因為研究表明其半衰期為42h。相反，MF59具有誘導細胞和體液免疫反應的強大能力，包括產生高滴度的功能性抗體。MF59的存在刺激局部先天免疫細胞分泌趨化因子，如C-C基序趨化因子配體4 (CCL4)，C-C基序趨化因子配體25 (CCL2)， C-C基序趨化因子配體5 (CCL5)和C-X-C Motif配體8 (CXCL8)，它反過來驅動白細胞募集、抗原攝取和遷移到淋巴結，觸發適應性免疫反應。另外，研究報道，MF59能夠增加調節白細胞跨內皮遷移的基因簇的表達，以及隨后招募的MHCII+CD11b+細胞進入注射部位，引發強大的免疫應答。在35個國家數百萬劑的應用證明了MF59是安全且耐受性良好。
2.2.2 AS03
AS03是由表面活性劑聚山梨酸酯80和角鯊烯和DL-α-生育酚兩種可生物降解的油脂在磷酸鹽緩沖鹽水中組成的油包水佐劑乳液。這種佐劑已用于流感疫苗，引起類似MF59的免疫反應，也用于瘧疾疫苗。2009年歐盟委員會批準AS03佐劑的疫苗Pandemrix上市，而2013年，美國食品和藥物管理局(FDA)獲批了一種AS03佐劑甲型流感(H5N1)單價疫苗。然而，α-生育酚的抗氧化和免疫刺激特性似乎比MF59增強了免疫刺激。事實上，在6至35個月的兒童中使用AS03佐劑流感疫苗顯示出強烈的免疫反應，甚至在接種疫苗6個月后也是如此。為了闡明DL-α-生育酚在AS03中的作用，我們比較了AS03和缺乏DL-α-生育酚的乳劑的作用。通過測定抗原攝取、免疫細胞募集和分泌的細胞因子水平，我們得出結論是缺乏DL-α-生育酚導致免疫應答和抗體滴度降低。而且，有研究表明AS03能夠通過激活NF-κB刺激免疫系統，誘導肌肉和淋巴結分泌細胞因子和趨化因子，促進先天免疫細胞的遷移。另外，AS03可刺激CD4+ T細胞特異性免疫反應，這可以決定持久的中和抗體產生和更高水平的記憶B細胞。AS03的成分進一步添加了兩種強免疫刺激劑，即QS-21(一種從黃芪中提取的皂苷)和3- O -去?；?40 -單磷酰脂質A (MPL)，以增強其免疫原性，從而形成AS02。
2.3 微粒
2.3.1 病毒樣顆粒
病毒樣顆粒(VLP)是由自組裝衣殼蛋白外殼組成的二十面體或棒狀納米顆粒(? 20 - 200nm)。長期以來，人們一直在研究并將其用于疫苗開發。它們是非傳染性粒子，因為它們不包含任何遺傳物質。它們是一種被稱為納米疫苗的最重要代表之一新型疫苗，這種疫苗在疫苗開發中正變得越來越重要。VLP是一種智能納米顆粒，因為它們是具有重復表位的外部病毒外殼形成，免疫系統將其識別為非自身，從而產生強烈的免疫反應。然而，它與天然病毒共有的這一特性，但并不具有感染的能力。除了這些重復的結構基序外，VLPs的大小與病毒相似(通常在20-800nm之間)，并且經過快速有效的處理，即使在沒有佐劑的情況下也能產生快速而持久的免疫反應。根據是否存在包膜，VLPs可分為非包膜VLPs和包膜VLPs (eVLP)，無包膜VLPs又可分為單衣殼蛋白VLPs和多衣殼蛋白VLPs，以及單層、雙層和三層VLPs。多衣殼無包膜的VLPs一個經典例子是由乳頭瘤病毒L1和L2蛋白形成的，它們能夠自組裝形成微粒。eVLP從宿主細胞獲得脂質膜，在組裝和出芽過程中表達，又分為單層、雙層和多層。它們可以由不同的病毒類型形成，其表達系統包括大腸桿菌，酵母(釀酒酵母和畢赤酵母)、桿狀病毒、哺乳動物細胞、植物細胞和無細胞系統。在細胞系統中生產VLP采用一種稱為“組裝-然后純化”的多步驟方法，首先利用衣殼蛋白的自發組裝能力直接出現在表達細胞載體內，其次純化新形成的顆粒。有時，為了獲得較純的顆粒，在細胞內組裝后，新顆粒必須分解，從而使它們第二次重新組合。另一種制造方法使用無細胞體外組裝加工系統，其組成與傳統細胞方法的相反，特別是，它們在表達和純化后，體外表達系統被用于生產衣殼蛋白自發組裝的平臺，而無需拆卸新形成的VLPs。目前，有兩種重要的添加佐劑的疫苗使用納米顆粒平臺產生免疫:乙型肝炎和乳頭瘤病毒(HPV)疫苗。當前，使用的乙型肝炎疫苗是一種含有乙型肝炎表面抗原的重組疫苗(HBsAg)，以VLPs的形式，用于預防乙肝感染，其利用重組DNA技術，以釀酒酵母為表達載體生產疫苗。每個劑量含有10μg/0.5 mL VLPs(兒童)或20μg/mL(成人)，兩者都吸附于氫氧化鋁。該疫苗接種于15歲以下的嬰兒、兒童和青少年，或感染乙型肝炎的高危人群，在乙肝病毒攜帶者母親所生的新生兒中也顯示出極好的免疫原性(95% - 99%的有效性)。乙肝疫苗似乎能提供至少10年的免疫力。
HPV疫苗也是基于VLP平臺的疫苗。HPV病毒粒子是非包膜的，含有雙鏈DNA (dsDNA)。衣殼具有二十面體對稱性，由主要結構蛋白和次要結構蛋白組成，即L1蛋白和L2蛋白。目前的九價HPV疫苗可預防九種不同的病毒基因型，這些病毒基因型可導致90%的宮頸癌和80-95%的肛門生殖器癌，建議從9歲開始對男性和女性接種。九價型HPV疫苗含有9種不同HPV基因型(6、11、16、18、31、45、53、58)的L1蛋白形成VLPs，并通過重組DNA技術合成。VLPs的優勢在于它是一種不含病毒基因組的蛋白質結構，不具有傳染性和致癌性。目前用于表達L1蛋白的載體是釀酒酵母。VLPs與佐劑(AlP)協同使用可產生良好的免疫應答，因此預防宮頸癌達90%。此外，事實證明，疫苗誘導的抗體能夠穿過胎盤，保護新生兒免受HPV 6和11的感染。
2.3.2 病毒顆粒
病毒體是一種與天然病毒結構非常相似的疫苗平臺。在結構上，它們是重組流感病毒包膜形成的VLPs，由血凝素(HA)、神經氨酸酶(NA)和磷脂(磷脂酰乙醇胺和磷脂酰膽堿)組成，缺乏病毒遺傳物質。1975年首次提出使用病毒顆粒生產流感疫苗。自此，出現了這類疫苗有效性的科學證據，并用于預防甲型肝炎(Epaxal)和流感(Inflexal)的兩種疫苗。Inflexal Ⅴ是一種適用于所有年齡組的佐劑流感疫苗，對健康和免疫功能低下的兒童、成人和老年人都有良好的療效。它能誘導B細胞應答并產生特異性抗體。病毒顆粒保留了血凝素的受體結合能力和膜融合活性，但缺乏病毒性RNA，它們結合后不能誘導細胞感染。而且與亞基和分裂病毒粒子流感疫苗相比，這種結合能力增加了它們的免疫原性。病毒顆粒作為一個完美的遞送系統，能夠將抗原轉移到抗原呈遞細胞(APCs)的細胞質中，并誘導細胞毒性T淋巴細胞(CTL)反應。然而，由于它們較弱的佐劑特性，病毒顆粒不能有效的激活APC和促進交叉呈遞。這種內在的限制可以通過添加更強的佐劑來去除。例如基于TLR4配體單磷酰脂質A (MPLA)和金屬離子螯合脂質DOGS-NTA-Ni吸附到膜上的病毒顆粒，研制了一種新型流感疫苗。在體外，與未添加佐劑的病毒顆粒相比，吸附了MPLA的病毒顆粒能夠誘導更強的APCs活化。此外，具有MPLA佐劑的病毒顆粒免疫小鼠誘導特異性CTLs的產生。
生產的流感病毒顆粒使用洗滌劑(乙二醇)-正十二烷基單醚(C12E8)溶解病毒包膜，隨后進行超離心并去除病毒核衣殼，然后，使用疏水珠從上清液中去除洗滌劑，隨后病毒膜脂和包膜糖蛋白重新組裝，形成約100-200 nm的顆粒。研究表明，這一過程形成的流感病毒顆粒表現出與野生型病毒非常相似的融合特性。流感病毒通過受體介導的內吞作用進入細胞，然后與核內體膜融合。由于膜融合活性，不同的大分子可以被包裹在病毒顆粒腔內到達靶細胞的細胞質。例如，包裹在病毒顆粒內的DTA(白喉毒素的A亞基)可以成功地轉運到靶細胞的細胞質中，導致蛋白質合成的完全抑制，甚至質粒DNA也可被包裹在陽離子脂質形成的病毒顆粒內。這種病毒顆粒DNA可以有效地轉染靶細胞。
病毒顆粒傳遞系統和佐劑的顯著優勢是能夠通過疏水脂質相互作用將抗原吸附到它們的表面和管腔上。而且，在疫苗生產中病毒顆粒比VLPs更受歡迎，因為后者由于其蛋白質結構運動受到限制。此外，將抗原吸附到病毒顆粒的液體磷脂雙分子層表面會刺激與宿主細胞受體的相互作用。FDA已批準病毒顆粒作為人類使用的納米載體，因為它們具有很高的耐受性和安全性。與亞單位疫苗引起較弱的免疫反應相比，病毒顆粒能夠誘導強大的體液和細胞免疫，這與自然感染和其他強效佐劑具有非常相似的方式。
目前為止，除了上述兩種流感和甲型肝炎的基于病毒顆粒的疫苗外，這幾種基于病毒顆粒的HIV、HPV、RSV和瘧疾疫苗也在研究。
艾滋病毒顆粒疫苗在臨床I期顯示出符合期望的結果，有可能很快會上市。盡管疫苗可以通過肌肉注射或皮下注射，但粘膜途徑可能引起更強的免疫反應，因為艾滋病毒傳播的主要途徑是粘膜組織，因此，強大的粘膜抗體產生是抵抗HIV感染的重要防御機制。研究人員已經從流感病毒中制備了基于HIV病毒顆粒的疫苗，其主要通過吸附一些HIV-1毒力抗原，如gp41和p1肽，并加入3M -052和一種增加病毒顆粒膜硬度的耐熱佐劑。另一項研究，一種熱穩定性的HIV-1病毒顆粒疫苗由流感包膜的病毒顆粒組成，其含有HA、NA、卵磷脂、腦磷脂和其他磷脂，外加3M-052、toll樣受體(TLR7/8)和海藻糖。
關于HPV，一些研究側重于含有E6和E7蛋白的基于病毒顆粒的疫苗，其通過受體介導的內吞作用與宿主細胞膜融合。研究表明，重組HPV16 E7流感病毒顆粒誘導了強烈的CTL反應，并阻止了HPV16+向癌癥轉化。此外，用E7病毒顆粒免疫誘導了抗E7的IgG抗體反應。
3.1 TLR1/2激動劑
在TLR1/2激動劑中，L-pampo是一種由Pam3Csk4(Pam3)和多肌苷:多胞苷酸(polyI:C)組成的強效佐劑體系，其分別為強效TLR1/2和TLR3激動劑。Lee等人研究表明L-pampo誘導的抗HBV抗體的產生比明礬更強，并且還參與細胞介導的免疫反應，如增加多功能CD4+ T細胞。此外，還研究了抗SARS-CoV-2的有效佐劑。具體而言，與廣泛使用的佐劑相比，SARS-CoV-2抗原如受體結合域(RBD)和S1抗原，或RBD- Fc接合L-pampo可對SARS-CoV-2產生強烈的體液和細胞免疫應答。
此外，細菌脂蛋白是TLR2識別的最有效的配體。研究表明，從細菌脂蛋白中提取的合成脂肽是B細胞和巨噬細胞的強激活劑，可以用作疫苗佐劑。來自發酵支原體的2 kDa巨噬細胞激活脂肽-2 (MALP-2)通過TLR2-和myd88依賴的信號通路激活免疫細胞。除MALP-2外，Pam2CSK4和Pam3CSK4也是公認的TLR2激動劑，它們已被評估為治療利什曼原蟲、瘧疾和流感等傳染病的藥物。
TLR3受體激動劑
在發現TLRs之前，一種合成的dsRNA，即[poly(I:C)]被發現具有高度誘導IFN產生的能力。TLR3是一種檢測病毒dsRNA的細胞核內體的受體，它識別poly(I:C)，因為它在結構上模擬病毒RNA，從而誘導I型IFN和III型IFN的產生，并引起Th1細胞因子反應。在TLR3- poly(I:C)相互作用后產生的I型IFN對于常規樹突狀細胞(cDCs)有效激活CD8 T細胞反應尤為重要。另外，poly(I:C)產生的I型IFN刺激T細胞的克隆擴增，增加效應T細胞的比例和抗原特異性B細胞的數量。由于這些原因，poly(I:C)作為一種潛在的佐劑已被廣泛研究，然而，poly(I:C)對人體有毒性作用。因此，科學家們的關注點已集中在poly(I:C)的衍生物，如poly(ICLC)和poly(IC12U)，以及其他合成的TLR3激動劑，如ARNAX, IPH3102和RGC100。Poly(ICLC)是羧甲基纖維素中的poly-L-賴氨酸，與poly(I:C)類似，其能夠刺激IFN的產生。然而，它對血清核酸酶具有較高的抗性，同時具有較高的免疫刺激作用。poly(ICLC)的一個有趣的方面是能夠誘導天然免疫途徑中其他幾個基因序列的表達，包括炎性體和補體系統AS，類似于活病毒疫苗。迄今為止，一些研究已經使用聚(ICLC)作為傳染病的候選疫苗，如惡性瘧原蟲和HIV以及癌癥。研究表明，與其他TLR激動劑(如LPS和CpG)相比，poly(ICLC)能夠引發更強的Th1免疫應答，這是疫苗接種的一個積極方面。Poly(IC12U)通過尿嘧啶和鳥苷殘基之間的錯配降低Poly(I:C)的毒性。然而，盡管這種變化降低了毒性，但它導致I型IFN的產量低于poly(I:C)。與poly(I:C)和poly(ICLC)不同，poly(IC12U)與TLR3結合，但不與MDA5結合。與poly(ICLC)類似，一些研究將ploy(IC12U)作為HIV、流感和癌癥疫苗的佐劑。ARNAX是一種具有佐劑潛力的TLR3激動劑，它是一種TLR3特異性配體，其毒性低于poly(I:C)。poly(I:C)的毒性與其激活MAVS通路(RIG-I和/或MDA5的激活)的能力有關。因此，Matsumoto等人開發了一種包括GpC磷酸化寡脫氧核苷酸和dsRNA的配體，該配體被TLR3識別并內化到核內體中。由于RNA鏈的長度相對較短，該配體能夠激活TLR3，同時避免MDA5的檢測。在小鼠模型中，佐劑不能誘導血清炎癥細胞因子水平的顯著增加，但有利于DC交叉呈遞抗原并引發Th1譜。研究ARNAX最重要的兩個領域是癌癥免疫治療和流感疫苗接種。
3.2 TLR4激動劑
TLR4激動劑作為疫苗佐劑有AS01、AS02和AS04，它們都含有TLR4內體的配體MPLA。
具體來說，AS01已被用于開發瘧疾、艾滋病毒和結核病的疫苗。AS01是一種包裹在脂質體結構中復合佐劑，其由兩種不同的免疫刺激分子MPLA和QS-21組成。QS-21是一種天然的三萜苷類皂苷類物質，提取自枇杷膏的樹皮。這兩種化合物利用脂質體作為載體通過膽固醇依賴性內吞作用到達細胞。在細胞內，QS-21導致溶酶體不穩定并促進蛋白激酶SYK的激活。MPLA連接內體TLR4，誘導TRIF依賴的信號通路。單獨使用QS-21具有重要而不利的溶血作用，可誘導細胞死亡。然而，溶血活性的QS-21和隨后的細胞死亡通過脂質體包封終止。AS01激活細胞凋亡蛋白酶-1，從而促進NLRP3炎性體的激活和從APCs中釋放IL-1β和IL-18。IL-18的釋放導致IFN-γ的快速產生，尤其是淋巴結中的自然殺傷細胞，從而促進DC的成熟并誘導Th1型免疫反應。
3.3 TLR5激動劑
TLR5是一種識別細菌鞭毛蛋白的受體，它由幾種免疫細胞表達。TLR5與配體的結合導致炎癥途徑的激活和許多炎癥介質的釋放，如TNF-α， IL-1β， IL-6和NO。此外，鞭毛蛋白能夠引起Th1和Th2反應，而不像其他TLR配體只能夠引起Th1反應。另外，鞭毛蛋白通過激活NLRC4炎性體誘導IL-1β的產生和釋放。鞭毛蛋白不依賴TLR5或NLRC4的模型能夠發揮佐劑活性，但效率低于野生型。事實上，在小鼠模型中這兩種受體都不存在時，佐劑的能力大大降低，這表明至少需要一種受體存在才能驅動免疫反應；而兩者的存在提供了最好的免疫結果。研究表明，鞭毛蛋白在免疫功能低下的人群中仍能維持其佐劑作用，例如HIV陽性的病人。Cui等評論了使用鞭毛蛋白作為佐劑的研究。最簡單的方法是抗原給藥，該方法成功地誘導了黏膜免疫反應，對防止呼吸道和胃腸道感染至關重要。研究人員已經開展了許多研究，特別是關于鞭毛蛋白作為流感疫苗佐劑的作用。鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白與不同的流感抗原聯合使用，如滅活的PR8流感病毒(IPR8)、HA(H5N1)和禽流感病毒(AIV)H5N1都獲得了強大的免疫反應(特別是產生IgA的粘膜)。在活減毒細菌中修飾的鞭毛蛋白獲得了嵌合鞭毛蛋白或鞭毛蛋白抗原復合物，例如結核分枝桿菌、霍亂弧菌、化膿性鏈球菌、單核細胞增生李斯特菌和產腸毒素大腸桿菌(ETEC)。此外，重組鞭毛蛋白-抗原融合蛋白的生產已在動物模型中用于傳染病和癌癥的佐劑疫苗。迄今為止，至少有三種用鞭毛作為佐劑的疫苗處于臨床試驗階段:兩種是流感病毒，另一種是鼠疫耶爾森氏菌。
3.4 TLR7/8激動劑
一些研究表明TLR7/8激動劑能夠強烈誘導Th1免疫應答。與TLR7/8結合的配體產生高水平的I型IFN，IL-12, TNF-α和IL-1β。另外，TLR7/8和TLR9激動劑是唯一能夠激活和促進cDCs和漿細胞樣樹突狀細胞(pDCs)克隆擴增的激動劑分子，也能調動CD14+CD16+炎癥單核細胞和CD14dimCD16+巡邏單核細胞。TLR7/8激動劑最重要的代表是一些合成的小分子，命名為咪喹莫特(R837)和瑞喹莫特(R848)，其屬于咪唑喹啉類。當今咪喹莫特被批準用于治療生殖器疣、淺表基底細胞癌和光化性角化病，而雷西喹莫特已被研究用于抗病毒和抗癌治療。然而，這些小分子已被證明有一些內在的限制。特別是，它們可以擴散到遠離給藥部位的地方，從而遠離抗原，從而降低療效并誘發全身副作用。因此，研究已證明這些分子與鋁佐劑的直接結合能夠提高疫苗的效力。先前的一些研究將咪唑喹啉類藥物與HIV-1 Gag蛋白或整個滅活流感病毒直接偶聯，增加了Th1應答和抗原特異性的T細胞數量。此外，它與合成聚合物支架、脂質-聚合物兩親體、聚乙二醇(PEG)、納米凝膠、明鋁和各種其他合成聚合物的偶聯顯著增加了咪唑喹啉類藥物的遞送，并促進了DC和抗原特異性T細胞的成熟。而且，咪唑喹啉與一種或多種其他TLR激動劑(如MPLA (TLR4)和MPLA + CpG ODN (TLR4和TLR9)混合研究表明，這種組合增加了先天免疫反應，產生了顯著抗原特異性中和抗體和改善Th1反應。所有這些創新方面都突出了TLR7/8激動劑作為佐劑候選藥物的卓越潛力。
3.5. TLR9激動劑
TLR9自然識別以未甲基化胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤(CpG)二核苷酸為代表的細菌DNA基序，通過myd88依賴途徑驅動先天免疫系統的激活。這些分子基序用于具有特定修飾的合成佐劑，以防止被核酸酶降解。在自然殺傷細胞、B細胞和pDCs中，CpG-ODNs產生強大的趨化因子、細胞因子和抗體，驅動強烈的Th1型免疫反應。迄今為止，研究人員已開發了三種不同類型的CpG-ODN配體，其分為三類(A - C)，但只有B類分子作為佐劑用于臨床試驗。CpG-B ODN定位于核內體并引起pDCs成熟。此外，CpG-B ODN可以直接與B細胞相互作用，增強抗體的產生。在小鼠模型中顯示，CpG-B ODN作為佐劑可產生可觀且持久的抗體，優于鋁佐劑或非佐劑疫苗。最近許可的CpG 1018是一種具有較高的化學穩定性和佐劑能力的寡核苷酸，可引發Th1型免疫反應，被用作乙肝疫苗Heplisav-B的佐劑。Heplisav-B中的CpG 1018提高了疫苗效力，與需要三劑才能產生最佳保護的傳統乙型肝炎疫苗相比，只需接種兩劑即可。目前為止，CpG 1018正在用于開發幾種疫苗，包括針對黑色素瘤和COVID-19的疫苗，另一種CpG ODN CpG 7909在HBV和瘧疾疫苗臨床評估中顯示出令人鼓舞的效果，其他下一代TLR9激動劑已開發。一個有效的代表是MGN1703，其包括CG基序的小DNA分子，但它在結構上不同于CPG ODN。MGN1703是一段中間為雙鏈的反向互補DNA組成，兩個單鏈環包圍，它包括三個非甲基化的CG基序并形成啞鈴狀結構，與線性分子CpG ODNs形成對比。MGN1703作為癌癥疫苗的佐劑進行了測試，發現它能夠激活先天和適應性免疫反應，只有輕微或暫時的副作用。
盡管疫苗具有良好的安全性，但近年來，人們對疫苗可能產生的負面影響產生了新的關注，除了眾所周知的副作用外，還描述了一種新的疾病分類學實體。最早由Shoenfeld等人提出實體是佐劑誘導的自身免疫/炎癥綜合征(ASIA)。這種綜合征包括一些免疫介導的疾病，這些疾病可能發生在暴露于佐劑后的易感遺傳個體中。其特征主要是自身抗體的產生，一旦觸發因子被移除，情況會好轉。該綜合征發病時，一些外部因素如感染性因子或佐劑(即粉塵、硅膠、鋁鹽等)作用于易感遺傳背景，其通過自身免疫性疾病(ADI)發展相關的特定HLA抗原介導。尤其是這些患者中HLA-DRB1和PTPN22基因同時存在已證明是最常見的自身免疫背景。根據最近的科學證據，一些病理情況，如結節病、Sj?gren綜合征(SS)、未分化結締組織病(UCTD)、硅膠植入物不相容綜合征(SIIS)和免疫相關不良事件(irAEs)是ASIA背景的典型例子。除了疫苗中含有的常見佐劑外，許多其他物質如硅酮、石蠟、透明質酸、丙烯酰胺和甲基丙烯酸酯也具有佐劑的特性。
Watad等人將ASIA標準分為主要標準和次要標準。在臨床表現之前，主要標準包括暴露于各種外源性刺激(感染、接觸佐劑)以及出現典型的臨床表現，如肌痛、肌炎、關節痛、關節炎、慢性疲勞、睡眠障礙、脫髓鞘、記憶喪失、發熱和口干。次要標準包括自身抗體或針對佐劑的抗體的出現，特定HLA模式(即HLA DRB1, HLA DQB1)的存在，以及自身免疫性疾病的發展，即多發性硬化癥或系統性硬化癥。
以前的一些研究表明含有鋁鹽的疫苗能引起ASIA。一個典型的例子是HPV四價疫苗(含鋁鹽)，據報道，接種疫苗后幾周內易感受試者的自我免疫風險會增加，它或者是HBV疫苗。然而，Linneberg研究鋁鹽潛在副作用結果表明，與接受常規過敏治療的對照組相比，經皮下多次過敏原聯合氫氧化鋁免疫治療以及隨后接受比三劑疫苗中含鋁量高100倍人死亡率更低，自身免疫性疾病更少。
科學家們的努力已轉向研究生物標志物診斷ASIA或預測它的易感性(除了之前已經提到的)。例如，在患有ASIA受試者中ACE 1和IL-2受體增加50%，維生素D的缺乏增加了ASIA的發病率(缺乏免疫調節作用)。通過對500例ASIA的分析，Watad等人強調了易感性似乎與ASIA非常相關。這項研究表明，女性個體、吸煙者、以往患有自身免疫性疾病或家庭成員患有后者的人患ASIA的比例較高。其中多基因自身免疫性疾病最為常見，UCTD和Sj?gren綜合征患病率最高，分別為38.8%和16.8%。在54.4%自身抗體檢測陽性的患者中48.2%為ANA陽性。很明顯，考慮到自身免疫/自身炎癥狀態的發展背后，其有環境和遺傳因素。接種疫苗與出現癥狀之間的中位時間為一周(2天至5年)；48.2%的人群在接觸至少一種疫苗后出現臨床癥狀。然而，除了這一科學證據外，一些研究表明接種佐劑疫苗與ASIA之間沒有關系。在這些研究中，已表明疫苗接種和自身免疫之間的聯系可能是虛假的，因為存在混淆因素和隨機事件的結果，而不是真正的因果關系。疫苗接種或接觸外來物質與自身免疫/炎癥和免疫介導事件的潛在發生之間可能存在的聯系不應成為降低疫苗接種覆蓋率的“虛假神話”。實際上，疫苗不良事件很少發生。由于缺乏信息和可靠的數據，亞洲是一個恰當的總括性術語，可以把各種事件和顯然不相關的反應集合在一起，這些反應的共同根源是暴露于疫苗、硅膠或其他外來物質。需要強調的是，即使未來的研究表明佐劑和自身免疫之間存在真正的相關性，然而，這不會削弱疫苗免疫實踐所發揮的巨大和毋庸置疑的保護作用，疫苗免疫實踐提供了許多臨床益處；事實上，疫苗有助于根除和控制許多傳染病，提高人類生活質量。
疫苗接種一直是人類與傳染病作斗爭的最有力武器之一。由于這些有效和安全的預防手段，人類已能消滅人類歷史上最可怕的敵人（病原微生物）。最近的COVID-19大流行充分強調了疫苗接種的重要性，疫苗研究必須取得進一步進展并為未來的大流行做準備。疫苗的效力取決于佐劑的基本特性和作用。關于疫苗接種的未來，必須更加重視這些分子，以便生產出越來越安全有效的疫苗。目前該領域的相關產品等研究正在進行，以便實現這一目標，造福人類。
