大規(guī)模 AAV 生產(chǎn)
大規(guī)模生產(chǎn)和商業(yè)化生產(chǎn)需要特定的細(xì)胞系特性，例如可放大性和高產(chǎn)量。細(xì)胞需要在低成本、無(wú)血清的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，系統(tǒng)應(yīng)該符合純度和安全的監(jiān)管要求。傳統(tǒng)上，基于懸浮的生產(chǎn)是在體積高達(dá) 50,000 L 的可重復(fù)使用不銹鋼生物反應(yīng)器 (STR) 或 15 mL - 2,000 L 規(guī)模的一次性 STR 中進(jìn)行的。STR 非常靈活，可提供廣泛的潛在操作條件以及基于充分理解的混合原理的高效氣體傳輸。
搖擺式生物反應(yīng)器也可用于規(guī)模高達(dá) 500 L 的懸浮培養(yǎng)。與 STR 不同，這些系統(tǒng)的可放大性有限，因?yàn)樗鼈儍H使用頂空通氣，但系統(tǒng)易于操作。例如，可實(shí)現(xiàn)的體積可用于中等規(guī)模的生產(chǎn)，作為大規(guī)模細(xì)胞生產(chǎn)的種子擴(kuò)增系列的一部分，以及用于生產(chǎn)（輔助）病毒種子儲(chǔ)備。這種懸浮培養(yǎng)中的細(xì)胞基質(zhì)在數(shù)千升的批次生產(chǎn)中顯示出遺傳穩(wěn)定性。
STR 中達(dá)到的細(xì)胞密度取決于細(xì)胞類型和培養(yǎng)基，但對(duì)于沒(méi)有細(xì)胞截留的批次培養(yǎng)，通常范圍在 5 - 20 × 10^6 cells/mL 之間。適用于 STR 和搖擺系統(tǒng)的灌流模式培養(yǎng)技術(shù)可以通過(guò)將細(xì)胞維持在最佳代謝狀態(tài)來(lái)增加細(xì)胞密度。例如，通過(guò)在線生物量測(cè)量和灌流速率控制，中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢 (CHO) 細(xì)胞的密度已達(dá)到 100 × 10^6 cells/mL。為了保持活性生物量，生物反應(yīng)器必須配備截留裝置，使其能夠以灌流模式運(yùn)行培養(yǎng)。
如此高的細(xì)胞密度有助于在產(chǎn)品生產(chǎn)開始之前縮短細(xì)胞擴(kuò)增軌跡。以更快的速度達(dá)到這些密度可以減少 GMP 生產(chǎn)設(shè)施內(nèi)用于細(xì)胞擴(kuò)增所需的時(shí)間和材料。此外，在基于病毒感染的生產(chǎn)系統(tǒng)中支持高細(xì)胞密度的能力為基于感染時(shí)細(xì)胞密度增加的工藝優(yōu)化和強(qiáng)化創(chuàng)造了機(jī)會(huì)。如果工藝工程師能夠保持細(xì)胞特異性生產(chǎn)率，那么感染時(shí)這種更高的密度將提供更高的單位體積生產(chǎn)率。
昆蟲細(xì)胞和懸浮馴化的 HEK293 細(xì)胞等懸浮細(xì)胞系可以在搖擺式反應(yīng)器和攪拌罐反應(yīng)器中使用無(wú)血清、化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基生長(zhǎng)，使其適用于 AAV 的大規(guī)模生產(chǎn)和商業(yè)化生產(chǎn)。Merten 對(duì)不同上游 AAV 生產(chǎn)系統(tǒng)的輸出進(jìn)行了全面的、基于文獻(xiàn)的比較，并得出結(jié)論，血清型和載體結(jié)構(gòu)的差異阻礙了真正的比較 - 但原則上，不同的生產(chǎn)系統(tǒng)都可以實(shí)現(xiàn) 5 × 10^13 至 2.4 × 10^14 vg/L。然而，使用基于 HEK293 轉(zhuǎn)染的工藝需要大量昂貴（高質(zhì)量、符合 GMP 標(biāo)準(zhǔn)）的質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑。
在 2019 年的一份成本比較報(bào)告中，Cameau 等人顯示每克質(zhì)粒 DNA 的成本為100,000 美元（定價(jià)基于 GMP 級(jí)質(zhì)粒的大批量訂單）。在他們的模型中，作者假設(shè)在 HEK293 懸浮培養(yǎng)中轉(zhuǎn)染 10^6 cells以生產(chǎn) AAV，需要 1.5 μg 質(zhì)粒 DNA，在 10^6 cells/mL 的轉(zhuǎn)染密度下，每生產(chǎn) 2,000 L，質(zhì)粒 DNA 需要投資 300,000 美元。用于病毒載體生產(chǎn)的、廣泛使用的基于 HEK293 的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染工藝很容易在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模上執(zhí)行，但其具有挑戰(zhàn)性的過(guò)程控制和可變性可能會(huì)在放大過(guò)程中造成困難。
BEVS 生產(chǎn)系統(tǒng)已經(jīng)使用了幾十年，從傳統(tǒng)的研究工具發(fā)展成為獸藥產(chǎn)品的生產(chǎn)系統(tǒng)，然后是用于生產(chǎn)人類治療藥物的生產(chǎn)技術(shù)。使用該系統(tǒng)的昆蟲細(xì)胞生產(chǎn)了多種供人類使用的許可疫苗和療法。其中包括 uniQure 的 Glybera 療法，它在 2012 年成為第一個(gè)獲得上市許可的基因療法，以及 2021 年的 COVID-19 疫苗。這樣的記錄證明，如果桿狀病毒在多個(gè)傳代中針對(duì)遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行了優(yōu)化，那么真正的BEVS 生產(chǎn)系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)。
例如，源于 S. frugiperda 的細(xì)胞系 - Protein Sciences Corporation 的 expressSF+ 細(xì)胞系 - 已被用于 Flublok 生產(chǎn)過(guò)程中的快速高效放大。有了它，公司在 2-L、10-L、100-L、650-L 和 2,500-L 規(guī)模上實(shí)現(xiàn)了相同的工藝性能，然后進(jìn)一步擴(kuò)大到 21,000-L 生產(chǎn)工藝。BEVS 使用標(biāo)準(zhǔn)化和完全表征的桿狀病毒種子庫(kù)來(lái)實(shí)現(xiàn)一致的上游生產(chǎn)。與 HEK293 轉(zhuǎn)染工藝相比，Sf9 細(xì)胞的感染不需要仔細(xì)的混合控制。在生產(chǎn)過(guò)程中，攜帶產(chǎn)生重組 AAV 載體所需基因的桿狀病毒被添加到生產(chǎn)生物反應(yīng)器中以感染 Sf9 細(xì)胞培養(yǎng)。該方法最大限度地減少了對(duì)培養(yǎng)系統(tǒng)的負(fù)面影響（來(lái)自治療性轉(zhuǎn)基因的表達(dá)），因?yàn)?AAV 載體中通常使用的哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子在昆蟲細(xì)胞中很少或沒(méi)有表達(dá)。
與 AAV 生產(chǎn)相關(guān)的挑戰(zhàn)包括生產(chǎn)過(guò)程的穩(wěn)健性低、AAV 滴度的高可變性以及含基因組顆粒的百分比低/可變。上游工藝的一致性對(duì)于使下游生產(chǎn)工藝能夠提供正確且一致的產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量至關(guān)重要。AAV 的大規(guī)模生產(chǎn)必須去除無(wú)法有效放大的下游技術(shù)：例如，離心和梯度超速離心。過(guò)濾和層析技術(shù)是優(yōu)選。
AAV 生產(chǎn)下游工藝的一個(gè)關(guān)鍵挑戰(zhàn)是解決和控制空衣殼和完整衣殼的混合物，空衣殼被認(rèn)為是工藝相關(guān)雜質(zhì)。為此，重要的是在上游產(chǎn)生盡可能高的完整/空衣殼比，從而簡(jiǎn)化隨后使用離子交換層析 (IEX) 在下游工藝中去除空衣殼的過(guò)程。它根據(jù)顆粒凈表面電荷的相應(yīng)差異來(lái)分離顆粒，對(duì)于 AAV，凈表面電荷根據(jù)其等電點(diǎn) (pI) 和環(huán)境 pH 值可以是正、中或負(fù)的。可以使用多種層析載體，包括膜層析（例如 Pall 的 Mustang S 型）、固定整體柱形式的對(duì)流相互作用介質(zhì)（來(lái)自 Sartorius BIA Separations 的 CIM）或基于顆粒的吸附層析（Cytiva 的 Sepharose 填料和 Thermo Fisher Scientific 的 POROS介質(zhì)）。
許多 AAV 血清型的 pI 已經(jīng)確定，完整 AAV 衣殼的 pI 略低于空衣殼，因?yàn)橐職そY(jié)構(gòu)中的 DNA 帶負(fù)電荷。盡管 pI 值差異很小，但 IEX 可以通過(guò)優(yōu)化的洗脫條件將它們分離。基于 IEX 的工藝是可重復(fù)的，可以自動(dòng)化并適應(yīng)滿足工業(yè)生產(chǎn)需求的大規(guī)模操作。然而，通常需要對(duì) IEX 方法進(jìn)行實(shí)質(zhì)性開發(fā)，因?yàn)榉蛛x空顆粒和完整顆粒的條件取決于它們?cè)谝職ず桶鼩げ《净蚪M之間的物理化學(xué)相互作用。
AAV 生產(chǎn)的監(jiān)管注意事項(xiàng)
基因治療開發(fā)人員非常感興趣的是加速批準(zhǔn)途徑。美國(guó)食品和藥物管理局 (FDA) 的加速批準(zhǔn)范例可以近似為四年時(shí)間框架，而不是產(chǎn)品批準(zhǔn)的典型 10-11 年 - 如果許可申請(qǐng)的化學(xué)、制造和控制 (CMC) 部分足夠穩(wěn)健，并且如果精心設(shè)計(jì)的早期臨床研究已證明其有效性。對(duì)于希望利用這種范例的公司，必須投資于商業(yè)就緒生產(chǎn)平臺(tái)的早期開發(fā)，這些平臺(tái)使用可以迅速擴(kuò)大到商業(yè)生產(chǎn)的工藝，盡快為 CMC 文件包生成可靠的數(shù)據(jù)。
盡管 BEVS 平臺(tái)需要在時(shí)間和資源上進(jìn)行前期投資，來(lái)生產(chǎn)和表征高質(zhì)量的桿狀病毒種子庫(kù)，但可通過(guò)快速和線性的放大軌跡來(lái)平衡這一點(diǎn)，并在工藝和其生物起始材料方面保持一致。在臨床開發(fā)或大規(guī)模 GMP 生產(chǎn)期間對(duì)基于 BEVS 的生物生產(chǎn)工藝進(jìn)行重大變更是一種潛在的策略，可能會(huì)帶來(lái)重大的技術(shù)和監(jiān)管挑戰(zhàn)并延遲項(xiàng)目。從一個(gè)高效、穩(wěn)健和可放大的生產(chǎn)平臺(tái)開始，開發(fā)具有成本效益的生產(chǎn)工藝對(duì)于滿足未來(lái)的治療需求將變得越來(lái)越重要。
商品成本是關(guān)鍵
據(jù)估計(jì)，到 2025 年全球基因治療市場(chǎng)價(jià)值將超過(guò) 100 億美元。這種增長(zhǎng)提供的機(jī)會(huì)導(dǎo)致開發(fā)用于臨床應(yīng)用的 AAV 載體的公司數(shù)量顯著增加，正在進(jìn)行的 AAV 臨床試驗(yàn)超過(guò) 250 項(xiàng)。對(duì)臨床前和臨床病毒載體生產(chǎn)能力的需求正在增加，以支持越來(lái)越多的基因治療開發(fā)項(xiàng)目。下一代 AAV 生產(chǎn)系統(tǒng)將需要生產(chǎn)足夠數(shù)量的治療載體。每個(gè)生物生產(chǎn)商都應(yīng)謹(jǐn)慎選擇能夠滿足其自身臨床和商業(yè)需求的生產(chǎn)系統(tǒng)。
基于轉(zhuǎn)染的生產(chǎn)平臺(tái)將為相對(duì)低劑量的孤兒病適應(yīng)癥提供足夠的產(chǎn)量（例如，Luxturna 治療眼病）。然而，隨著基因治療領(lǐng)域轉(zhuǎn)變?yōu)橐粋€(gè)為更多患者群體服務(wù)的行業(yè)，其載體需要系統(tǒng)給藥，以應(yīng)對(duì)越來(lái)越多的疾病適應(yīng)癥，生產(chǎn)能力估計(jì)需要增加一到兩個(gè)數(shù)量級(jí)。
一旦 BEVS 在分子和工藝水平上得到適當(dāng)設(shè)計(jì)，昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)就具有明顯的潛力，可以提供具有有利商品成本 (CoG) 的先進(jìn) AAV 生產(chǎn)系統(tǒng)。這將有助于該行業(yè)解決對(duì)病毒載體不斷增長(zhǎng)的需求。
原文：F.Hoeksema, H.van der Schaar, P.Puri, et al., Large-Scale AAV Production: Advantages of an Insect-Cell Baculovirus Expression Vector Platform. Bioprocess Insider, 2023.
